بخشی از مقاله
چکیده
آنزیمپکتیناز یکی از مهمترین آنزیمهای صنعتی جهان محسوب میشود که توسط طیف وسیعی از میکروارگانیسمها مانند باکتریها و قارچهای رشتهای تولید میشود. این آنزیم استفادههای زیادی در صنایعی مانند آبمیوهسازی، نساجی و روغنکشی دارد. در این پژوهش جداسازی و بهینهسازی باکتری تولیدکننده آنزیم پکتیناز از خاک باغات همدان بررسی شد. جداسازی این باکتریها از محیطهای باغ، مزرعه کاهگندم ومحل تخلیه زبالهها انجام شد. جداسازی باکتری در محیط کشت حاوی پکتین به عنوان تنها منبع کربن، با استفاده از معرف لوگول صورت گرفت و رنگ آمیزی گرم و تعیین توالی 61S rRNA برای شناسایی سویه انجام شد. بیشترین میزان تولید آنزیم پکتیناز مربوط به باکتریهای جداشده از خاک باغات بود. توالی این باکتری قرابت نزدیکی با سویه Bacillus thuringiensis داشت.
بهینهسازی تولیدآنزیم از این باکتری توسط روش پاسخ سطحی RSM - - ، در حضور 1 فاکتورمتغییر در 5 سطح بررسی شد. این 1 فاکتور شامل: منبعکربن - پکتین، پلیگاالکترونیک-اسید، سبوسگندم، شلتوکبرنج و تفالهسیب - ، منبع نیتروژن - اوره، عصارهگوشت، پپتون، تریپتون، آمونیومسولفات و آمونیوم-کلرید - و دما، pH ، زمان و میزان تلقیح است . که به ترتیب بهینه منبعکربن، تفالهسیب، بهینه منبعنیتروژن، تریپتون و بهینه دما 44/78 درجه،pH= 5/3 ، زمان 44ساعت و میزان تلقیح % 4/4 است. سپس آنزیم تولید برای تعیین بهینه فعالیت آنزیمی بررسی شد و نتایج بدست آمده به این صورت است که آنزیم جدا شده دردمای 33 درجه وpH=9 و در حضور یون کبالت به عنوان شرایط بهینه فعالیت آنزیمی نشان داده شدند.
کلمات کلیدی: پکتیناز، پلیگاالکترونیکاسید، Bacillus thuringiensis، RSM - Response Surface Methodology -
مقدمه
بیوتکنولوژی دانشی است که درپهنه وسیع آن ازامکانات ژنتیکی موجودات زنده برای بهبود زندگی بشر استفاده میشود. بسیاری این اصطالح را به فرایندهای صنعتی که در آنها از موجودات زنده برای تولید مواد مختلف اعم از غذایی، دارویی و شیمیایی استفاده میشود، اطالق میکنند. امروزه با تکیه بر دانش بیوتکنولوژی محصوالت بسیار با ارزشی ازمیکروارگانیسمهای مختلف به دست میآید. از جمله این محصوالت میتوان به انواع متنوعی از آنزیمها اشاره کرد. یکی از اهداف فعالیتهای بیوتکنولوژیک تولید و دستورزی آنزیمها است. آنزیمها ترکیباتی بسیار پیچیده هستند که به طور طبیعی در واکنشهای بیولوژیک نقش کاتالیزور را بر عهده دارند - نجار و همکاران،. - 6393 مواد پکتیکی، ماکرومولکولهایی با ساختمان پلیساکاریدی بوده که بخشی از دیوارهسلولی و الیههای میانی سلولهای گیاهان عالی را تشکیل میدهند.
این مواد باعث باال رفتن گرانروی محلولها در هنگام تولید آبمیوه و در نتیجه سبب پایین آمدن کارایی فرآیند پرسکردن و گرفتگی غشاء فیلتر و کاهش میزان بازیابی آبمیوه میگردند. از طرف دیگر وجود این مواد در آبمیوه تولیدی باعث ایجاد کدری، تشکیل لخته و دو فازی شدن آن میشود. این مواد در صنایعنساجی و کاغذسازی نیز سبب ایجاد مشکلی شده که بایستی به گونهای حذف شوند. یکی از مؤثرترین و معمولترین راههای حذف مواد پکتیکی استفاده از آنزیمهای پکتیکی - پکتیناز - میباشد. این آنزیم سبب تخریب مولکولهای پلیمری مواد پکتینی و کاهش گرانروی محلولهای حاوی این مواد میشوند - کاشیاب و همکاران، .6 - 4336 آنزیم-های پکتینولیتیک دستهای از آنزیمهای هیدرولیتیک4 تجزیه کننده پکتین میباشند. آنزیمهای پکتیک به طور کلی شامل سه گروه آنزیم موسوم به پکتین استراز3 ، پلی گاالکتوروناز4 و پکتین لیاز5 میباشند. آنزیمهای پکتینازی1 که به کار میروند عمدتا دو نوع هستند :
پکتینازهای اسیدی و قلیایی - سمنوا و همکاران، .8 - 4333آنزیم پکتین استراز تحت عنوان پکتین متیل هیدروالز7 هم شناخته میشود و گروه متوکسیل9 را از پکتین جدا میکند. این آنزیم در گیاهان عالی، باکتریها و قارچها یافت میشود و به میزان زیادی در گوجهفرنگی و مرکبات وجود دارد. آنزیم پلی-گاالکتورناز به پکتیناز هم مشهور است و پیوندهای گلیکوزیدی آلفا - - 4- 6 را هیدرولیز میکند وبه دوصورت وجود دارد. یکی پیوند گلیکوزیدی را در یک زنجیره مولکولی عاری از گروه متوکسیل - اسیدهایپکتینیک - میشکند و دیگری اتصالهای گلیکوزیدی درزنجیرههای حاوی گروه متوکسیل را تجزیه میکند. آنزیم پکتاتلیازعمل شکستن پیوندهای گلیکوزیدی را به گونهای انجام میدهد که با جداشدن دو اتم هیدروژن از کربنهای شماره 4 و 5 به همراه آن یک پیوند دوگانه میان این دو کربن برقرار شود - الکوترا و همکاران، .63 - 6997
آنزیمهای پکتیک از نظر صنعتی بویژه در صنایعغذایی از ارزش باالیی برخوردارند، از آنجایی که برای تجزیه ترکیبات پکتیکی که در الیه میانی دیواره سلولی بافتهای گیاهی وجود دارند مورد نیاز هستند.کاربردهای آنزیم پکتیناز عبارتند از: تجزیه ضایعات پکتینی کشاورزی، کاهش میزان پکتین مواد اولیه در صنایعغذایی و شفاف سازی آبمیوه ها، نرمکردن چوب در صنعت کاغذ و سایر مصارف در صنایع نساجی، فرآوری فیبرهای گیاهی، چای ، قهوه و استخراج روغن - جایانی و همکاران، ..66 - 4335ساالنه میلیونها دالر برای خریداری این آنزیم توسط صنایع ذکر شده صرف میشود. این آنزیم توسط بسیاری از قارچها و باکتریها سنتز شده و میتوان آن را با استفاده از فرآیندهای بیوتکنولوژی در مقیاس صنعتی و آزمایشگاهی تولید کرد.
همچنین ساالنه میلیونها تن ضایعات تفاله میوههای مختلف در کارخانههای تولید آبمیوه و کنسانتره در سراسر دنیا تولید میشود که بدون استفاده به طبیعت برمیگردد و بعضا سبب آلودگی محیطزیست میشود. این مواد زائد میتوانند گزینه مناسبی برای مصرف میکروارگانیسمها به عنوان منبع کربن برای تولید آنزیمهای پکتیک باشند.در گذشته این آنزیم از میوههااستخراج می شد. اما امروزه به دلیل افزایش تقاضا، استفاده از منابع میکروبی افزایش یافته است. استفاده از منابع میکروبی عالوه بر تسریع فرآیند تولید آنزیم منابع گیاهی را نیز بیشتر حفظ میکند - خسروی و همکاران، . - 6394آنزیمهای تولید شده توسط میکروارگانیسمها حدود 93 درصد از کل آنزیمهای مورد استفاده صنایع را تامین میکنند.
با توجه به نیاز روزافزون به این آنزیم ، پژوهش درمورد تولید مقرون به صرفه آنها ضروری میباشد. انتخاب ارگانیسم مناسب نقش کلیدی در تولید باالی آنزیم تجاری دارد. پکتینازها معموال به روش میکروبی و به عنوان یک محصول برون سلولی توسط میکروارگانیسم تولید میشوند میکروارگانیسم های تولید کننده آنزیم های تجزیه کننده پکتین عبارت اند از : مخمرها، باکتری ها و گونه های زیادی از قارچ ها، حشرات و پروتوزوآها - پدرولی و همکاران، 64339، جایانی و همکاران ، 53. - 4335 % پکتینازهای صنعتی از قارچ ها و مخمرها، %35 از باکتری ها و %65 هم از گیاهان و حیوانات تولید می شود - آداپا و همکاران، .4 - 43364 پکتینازهای میکروبی 63 تا % 45 از فروش آنزیم های صنایع غذایی در بازار را تشکیل می دهند که تقریبا همه آنها از منابع قارچی تولید می شوند - جایانی و همکاران، . -
4335 در حال حاضر مهمترین منبع تولید تجاری آنزیمهای پکتیکی، آسپرژیلوس نایژر است - کاشیاب و همکاران، . - 4333 پکتینازهای قلیایی توسط باکتری ها تولید میشوند. تاکنون نمونههای فراوانی از این باکتریها از منابع مختلفی از جمله آب، خاک - باغات میوه - ، ضایعات کشاورزی جداسازی و شناسایی شدهاند. باکتری Bacillus spp. پکتینازهای قلیایی تولید میکنند که در زمینههای متعدد صنعتی کاربرد دارد - هوندال و همکاران، .3 - 4334از جمله میکروارگانیسمهایی که توانایی تولید این آنزیمها را دارند میتوان به گونههای باسیلوس، سودوموناس4 ، اکتینومیستها5، آسپرژیلوس1 و پنیسیلیوم8 اشاره کرد - رضایی و همکاران،. - 6377
بنا به دالیل زیر میکروارگانیسمها به عنوان منابع آنزیمی نسبت به گیاهان و جانوران ترجیح داده میشوند: .6 برای تولید عموما ارزانترند. .4 آنزیمهای موجود در آنها بیشتر قابل پیشبینی و کنترل هستند. .3 بافتهای گیاهی و جانوری مواد مضر بیشتری دارند - مانند ترکیبات فنلی7 در گیاهان، مهارکنندههای داخلسلولی و پروتئازها.4 . - 9 دستورزی ژنتیکی میکروبها نسبت به گیاهان و جانوران راحتتر است. .5 میکروارگانیسمها را می توان در مقادیر باال و در مدت زمان نسبتا کمی کشت داد. .1 پروتئینهای میکروبی اغلب نسبت به همتاهای جانوری و گیاهی خود پایدارترند - والش، 4334، ص.63 - 319-348
