بخشی از مقاله
چکیده
گرافین یک آلوتروپ کربن دو بعدي است که در آن اتمهاي کربن در شبکهي شش گوشهاي قرار گرفته اند. اکسید گرافین به عنوان یک پیش مادهاي قابل کاربرد براي سنتز نانو مواد با خواص جدید است. عوامل بسیاري ممکن است برهمکنش بیولوژیکی این مواد با سلولها را تحت تاثیر قرار دهند، که غلظت نانوورقههاي اکسید گرافین یکی از این عوامل است. در این پژوهش ابتدا گرافیت با استفاده از روش بهبود یافتهي هامرز اکسید شده، و سپس با استفاده از شوك امواج فراصوت متورق گردید. نمونه ها با استفاده از طیف سنجیهاي مرئی-فرابنفش، طیف سنجی تبدیل فوریه مادون قرمز، و رامان مشخصهیابی شدند. در نهایت تست ضد باکتري در غلظتهاي متفاوت GO براي دو نوع باکتري گرم مثبت و گرم منفی انجام شد. نتایج نشان داد که فعالیت ضد باکتري این ورقهها وابسته به غلظت اکسید گرافین است. بهطوریکه با افزایش غلظت اکسید گرافین - 800μg/mL - نرخ غیرفعال سازي - میزان مرگ - سلولهاي باکتري بالا میرود. بهعلاوه نتایج نشان داد که نانوورقههاي اکسید گرافینی نسبت به باکتري گرم مثبت در مقایسه با باکتري گرم منفی داراي سمیت بیشتري هستند.
واژگان کلیدي: اکسید گرافین، ضد باکتري، گرم مثبت و گرم منفی
۱- مقدمه
گرافین یک آلوتروپ کربن دو بعدي با یک شبکهي شش گوشهاي با هیبرید٢ sp است. این ماده داراي خواص شیمیایی و فیزیکی یکتا مانند: رسانایی الکتریکی بالا حدود - ١S-١V-٢ - 200000 Cm، رسانایی حرارتی - ١K-١ - 5000 Wm-، استحکام مکانیکی عالی با مدول یانگ 1 TPa و اثر هال کوانتومی غیر عادي و نسبت سطح به حجم بالا - ١g-٢ - 2630 m است.گرافین عامل دار در زمینههاي بیو لوژیکی و پزشکی از جمله ضد باکتري، دارورسانی، بیو پزشکی، تشخیص سرطان، مهندسی بافت، ودرمان گرمادهی نوري - فتوترمال - کاربرد فراوانی دارد .[2 ,1]اکسید گرافین - GO - یک ورقهي گرافین با گروههاي کربوکسیل در لبههاي آن و گروه هاي اپوکسید و فنل هیدروکسیل در صفحات پایهي آن میباشد.
در این راستا، اکسیداسیون شیمیایی و به دنبال آن لایهبرداري از اکسید گرافیت به عنوان یک روش متداول براي سنتز ورقههاي GO مورد استفاده قرار میگیرد .[3]این ماده به دلیل بالا بودن نسبت اندازهي جانبی به ضخامت اتم، به عنوان یک نانوساختار ایدهآل براي تعامل مستقیم با میکروارگانیسمها به کار میرود.عوامل زیادي ممکن است فعالیت ضد باکتري این مواد را تحت تاثیر قرار دهند، از جمله خواص مواد مانند: اندازه، ساختار الکترونی و خواص شیمیایی سطح ؛ و شرایط تعامل بین نانو مواد و سلولهاي باکتري .[5 ,4] به علاوه فعالیت ضد باکتري این مواد به قابلیت پراکندگی آنها نیز نسبت داده میشود که ناشی از گروههاي عاملی موجود روي این ورقه ها است .[6]
تا کنون مطالعات زیادي روي فعالیت ضد باکتري اکسید گرافین انجام شده است. به عنوان مثال Krishnamoorthy - ، - 2012 فعالیت آنتیباکتریال نانوورقههاي گرافین را نسبت به باکتريهاي بیماري زا توسط روش میکرورقت اندازهگیري کردند .[7] همچنین تاثیر اندازههاي ورقههاي اکسید گرافین به فعالیت تکثیر باکتري E.Coli توسط Liu - ، - 2012 و همکاران مطالعه شد .[4]در این مقاله ابتدا ورقههاي اکسید گرافین با استفاده از روش بهبودیافتهي هامرز سنتز شد و توسط طیف سنجیهاي مرئی-فرابنفش، طیف سنجی تبدیل فوریه مادون قرمز، و رامان مشخصهیابی شد. در ادامه فعالیت ضد باکتري وابسته به غلظت ورقههاي GO نسبت به دو نوع باکتري گرم منفی E.Coli سویه ي BL21 - DE3 - و گرم مثبت Corynebacterium - C.g - glutamicum با استفاده از روش مک فارلند مورد ارزیابی قرار گرفت.
۲- بخش تجربی
-1.2 آماده سازي اکسید گرافین
ابتدا 0/1 gr گرافیت به 15 ml اسید سولفوریک %98 اضافه شد ظرف حاوي مواد فوق با مخلوط آب و یخ در صفر درجهي سلسیوس نگهداري شد. در ادامه 0/3 gr پرمنگنات پتاسیم پودر شده به آرامی به محلول بالا اضافه گردید و مجدد اجازه داده شد تا به مدت 5 دقیقه در این حالت باقی بماند. سپس مخلوط به مدت 2 h در دماي 40 درجه با 1200 rpm همزده شد تا محلولی به رنگ سبز حاصل گردد. در ادامه محلول با استفاده از حمام آب و یخ سرد گردیده و توسط 300 ml آب دیونیزه رقیق شد. سپس پراکساید به آرامی به محلول بالا اضافه گردید تا باقی پرمنگنات از محیط حذف شود و گاز هیدروژن آزاد گردد. سپس محلول به دست آمده آنقدر با آب دیونیزه شسته شد تا PH آب ورودي با PH آب خروجی برابر شود. مادهي به دست آمده اکسید گرافیت است. در ادامه نمونهي حاصل با شوك امواج فراصوت به مدت 30 دقیقه در KHz 40 متورق شده که در این حالت پیوندهاي گرافیت ضعیف شده و لایه لایه میگردد، سرانجام با استفاده از سانتریفیوژ، اکسید گرافین با تعداد لایههاي مختلف جداسازي میگردد.
-2.2 مواد و دستگاه
پودر گرافیت و پتاسیم پرمنگنات - KMnO4 - از شرکت سیگما-آلدریچ و اسید سولفوریک - ۴SO٢ - H و هیدروژن پراکساید S4 - ٢ - H از شرکت مرك خریداري شد. اسپکتروفتومتر مدل DR 5000، دستگاه انکوباتور مدل 311DS، اولتراسونیک مدل DSA-SK، سانتریفیوژ یخچالدار Universal 320R ، اتوکلاو مدل 110N، هود لامینار تیپ 2، هیتر-استیرر مدل MR .300IK
-3.2 آماده سازي سلول
سلولهاي باکتري BL21 و C.g در محیط کشت مایع به مدت 12-14 h با 180 rpm در دماي 37 درجه قرار داده شد. سوسپانسیون سلول باکتري توسط آب استریل رقیق شد و محلول حاصله به مدت 7 min در دماي 4 درجه با 5000 rpm سانتریفیوژ شد. این مرحله ي شست و شو در سه مرحله انجام شد تا محیط کشت موجود در محلول بهطور کامل حذف گردد. در نهایت رسوب باکتري بهدست آمده مجددا در آب به حالت تعلیق در آمد.
-4.2 تست آنتیباکتریال
قابلیت بقاي سلول BL21 و C.g در هنگام مجاورت با نانوورقههاي اکسید گرافین با استفاده از روش مک فارلند مورد بررسی قرار گرفت. به طور مختصر ابتدا همهي نمونهها و وسایل مورد نیاز توسط اتوکلاو در دماي 121 درجه به مدت min 20 استریل شد. سلول رسوب باکتر ي معلق در آب به همراه سوسپانسیون اکسید گرافین در غلظت هاي متفاوت 100 - ، 200، 400، 800 و - 1000 μg/mL به مدت 2 h با 180 rpm در دماي 37 درجه انکوبه شد. در ادامه مقدارهاي یکسانی از هریک از سوسپانسیون هاي بهدست آمده وارد 10 mL، LB مایع شد و به مدت 12-14 h با 180 rpm در دماي 37 درجه انکوبه شد. سپس تعداد باکتريهاي حاصله با استفاده از روش مک فارلند نسبت به LB کنترل - فاقد اکسید گرافین - مورد ارزیابی قرارگرفت. همهي آزمایشات در سه مرحلهي جدا از هم تکرار شد و مقدار متوسط آن ها گزارش گردید.
-3 نتایج و بحث
-1.3 مشخصه یابی اکسید گرافین
نانو ورقههاي اکسید گرافین همانطور که در ابتدا توضیح داده شد تهیه گردید. این صفحات درون آب داراي بار منفی بوده و به دلیل وجود دافعهي الکترواستاتیک بین ورقهها، سوسپانسیون آبی پایداري از این مواد ایجاد میشود که این امر موجب فعل و انفعالات بیشتر با سلول باکتري میگردد. به منظور مشخصهیابی این نانوورقه ها از طیف سنجی UV-Vis استفاده شد که در شکل 1 نشان داده شده است. همانطور که در شکل مشخص است این ورقهها یک پیک جذبی شدیدي در 231 nm دارند که مربوط به حلقهي آروماتیک C-C پیوند π- π* است.
