بخشی از مقاله
چکیده
تخریب زیستی ، تجزیهی شیمیایی مواد با استفاده از انواع ریزاندامگانها یا دیگر منابع زیستی است. بیسفنول A به طور معمول در صنایع شیمیایی با اثرهای سمی بر روی اندام های زنده مورد استفاده قرار می گیرد. در این مطالعه، از بیسفنول سنتزی برای بررسی تخریب زیستی و کاهش غلظت بیسفنول A به وسیله ی دستگاه رنگ سنجی استفاده شد. غلظت بیسفنول A برای آزمایش در محدوده ی 0/5 میلی گرم بر لیتر تا 20 میلی گرم بر لیتر گرفته شد تا اثر و درصد تخریب زیستی بیسفنول A در محیط های با غلظت پایین و غلظت های بالا مورد مطالعه قرار بگیرد.
این غلظت ها در دمای 30 درجه سانتی گراد تحت تلقیح باکتری رالستونیا یوتروفا قرار گرفت. رالستونیا یوتروفا، باکتری ای گرم منفی با قابلیت بالای حذف مواد آروماتیک است. این باکتری یک باکتری هوازی است که قابلیت ادامه ی فعالیت در شرایط بی هوازی را نیز دارد. یکی از موارد مثبت در انتخاب این ریزاندامگان این است که رالستونیا یوتروفا بیماری زا نیست. این باکتری توانست بین %10 تا %50 از این مادهی سمی، خطرناک و پیچیده را در غلظتهای اولیه مختلف تخریب کند.
مقدمه
تخریب زیستی، تجزیهی شیمیایی مواد با استفاده از انواع ریزاندامگانها یا دیگر منابع زیستی است. این عبارت اغلب در رابطه با مسائل بوم شناسی، مدیریت پسماند و زیست پالایی استفاده میشود.
مواد مختلف، ممکن است به صورت هوازی همراه با اکسیژن یا به صورت غیرهوازی بدون اکسیژن تجزیه شوند. در این روش ریزاندامگانها - به ویژه باکتریها و قارچها - نقش اصلی را در فرآیند تصفیه برعهده دارند چرا که آنها با استفاده از سازوکارهای درونی خود، مواد آلی موجود در پساب را جذب کرده و از آن برای رشد و کسب انرژی استفاده میکنند. روشهای زیستی قادرند با هزینهای پایین، طیف گستردهای از آلایندهها را تصفیه کنند. خاصیت انتخاب پذیری بالای ریزاندامگان در شناسایی و حذف مادهی مورد نظر مزیت دیگر آن است. از ویژگیهای قابل تامل این روش می توان به عدم تولید آلایندههای جانبی در حین فرآیند تخریب در صورت معدنی شدن آلاینده هدف اشاره کرد.
بیسفنولA ترکیبی بر پایهی کربن به فرمول شیمیایی - CH3 - 2C - C6H4OH - 2 است و متعلق به مشتقات گروه دی فنیل متان است. در این متن از این پس به جای واژهی بیسفنولA از واژهی بیسفنول برای راحتی استفاده میشود. از بیسفنول برای ساخت نوع خاصی پلاستیک و اپوکسی رزین استفاده میشود.[2] پلاستیکهای تولید شده بر پایهی بیسفنول شفاف و سخت هستند و برای ساخت اجناس گوناگونی مورد استفاده قرار می گیرند - مانند بطریهای آب و شیر کودکان، وسایل ورزشی و انواع لوحهای فشرده - .
شکل :1 فرمول شیمیایی بیسفنول
این ترکیب دارای دو گروه هیدروکسی فنیل و به صورت جامدی بی رنگ است که قابلیت حل شدن در حلالهای آلی را دارد اما قابلیت حل شدنش در آب در حدود 120ppm تا 300ppm است که مقدار پایینی است. بیسفنول دارای فشار بخار 5×10-6 پاسکال است
از سال 2008 ، تعدادی از کشورها در مورد ایمنی آن تحقیقاتی را انجام دادهاند که باعث شد تعدادی از تولیدکنندگان خرد از محصولات پلیکربنات استفاده نکنند. پس از اینکه در سال FDA 2010 خطرات احتمالی این ترکیب را برای جنینهای انسانی، نوزادان و کودکان در مقاله ای گزارش کرد ،مطالعات گستردهتری در مورد این ترکیب انجام شد. ظرفیت تولید جهانی این ترکیب در دهه 1980 در حدود یک میلیون تن بود و تا سال 2009 این مقدار به چیزی در حدود 2/2 میلیون تن رسید. تولید جهانی بیسفنول با توجه به گزارشهای مکتوب تحقیقات و مشاورهی بازرگانی تا سال 2015 به بیش از 5/4 میلیون تن خواهد رسید.
بیسفنول برای اولین بار توسط یک شیمیدان روسی به نام الکساندر پی دیانین در سال 1891 سنتز شد. [5] این ترکیب به وسیله ی میعان شدن استون - وجود پسوند A در انتهای نام ترکیب به این دلیل است - به همراه دو حلقهی همارز فنول ترکیب شده است. واکنش آن با یک اسید قوی کاتالیز میشود. از آنجایی که این ترکیب یکی از مونومرهای کلیدی پلاستیکهای پلیکربنات است و به خاطر خاصیت ضدحریق بودنش به طور گسترده در تولید روکشهای قوطیهای غذایی و نوشیدنی استفاده شده است و احتمال نفوذ این ترکیب در مواد درون قوطی و سپس ورود آن به بدن از عوامل اصلی نگرانی های سازمانهای سلامت است.
ر. یوتروفا یک باکتری گرم منفی میلهای شکل است که توانایی تولید اسپور ندارد و برخلاف بسیاری از باکتریهای گرم منفی بیماریزا نیست. [6] این باکتری به وسیله ی دو تاژک توان حرکت دارد و هوازی دوگانهزیست است طوری که میتواند در محیطهای هوازی و بیهوازی زنده بماند و بهترین دما برای رشد آن دمای 30 درجه سانتی گراد است
ر. یوتروفا در منابع خاکی و آبی یافت میشود اما خاصیت نمک دوستی در این باکتری وجود ندارد و در نتیجه در محیط های نمکی توان رشد ندارد. این باکتری به خوبی میتواند در محیطهایی که حاوی فلزات سنگین همچون روی، کادمیوم، کبالت، سرب، جیوه، نیکل و کروم هستند زنده بماند و رشد کند. دلیل اهمیت ر. یوتروفا در بیوتکنولوژی امکان استفاده از این باکتری در تخریب زیستی گسترهی وسیعی از مواد آلایندهی مقاوم همچون ترکیبهای کلرو آروماتیک، فنول و مشتقاتی از این دست میباشد.[6] همچنین این باکتری در حذف زیستی فلزات سنگین کاربرد داشته و در تولید پلیمر طبیعی پلیهیدروکسی بوتیرات - PHB - کاملا شناخته شده است.
استفاده از باکتری ر. یوتروفا در تخریب زیستی بیسفنول برای اولین بار صورت می پذیرد.
مواد و روشها
مواد شیمیایی بیسفنول با خلوص %99 از شرکت کره ای اینچئون خریداری شد.
آمونیوم کلراید، منیزیم سولفات هفت آبه، پتاسیم دی هیدروژن فسفات، دی پتاسیم هیدروژن فسفات از شرکت آلمانی مرک خریداری شد. پتاسیم فری سیانید ،سدیم هیدروژن کربنات و -4آمینو آنتی پایرین از شرکت آلمانی مرک خریداری شد.
محیط کشت از نوترینت آگار برای کشت مجدد باکتری رالستونیا یوتروفا استفاده شد. مواد موجود در محیط مایع برای تخریب زیستی بیسفنول توسط باکتری در جدول 1 آمده است.
تهیه نمونه
در این مطالعه بیسفنول به صورت سنتزی آماده شد و در ارلن مایر به حجم 250 میلی لیتر ریخته شد. درون ارلن مایرها ، 100 میلی لیتر از بیسفنول با محدوده ی غلظت های 0/5 میلی گرم بر لیتر تا 20 میلی گرم بر لیتر به همراه محیط کشت که در جدول 1 آورده شده است و باکتری ر. یوتروفا ریخته شد.
اختلاط نمونه ها به این صورت انجام می شد که ابتدا محیط کشت در آب حل می شد و به مدت 20 دقیقه در دمای 121°C اتوکلاو می شد سپس زیر هود و در کنار شعله 30 میلی لیتر باکتری
جدول :1 ترکیبات موجود در محیط کشت باکتری ر.یوتروفا
باکتری حل شده درون آب به محیط کشت اضافه می شد و در نهایت غلظت موردنظر از آلاینده به ارلن مایر اضافه می شد و سپس در شیکر و انکوباتور با دور 150rpm و دمای 30œC قرار داده می شد. نمونه ها هر روز در ساعت مقرری مورد سنجش قرار می گرفتند و بنا بر سرعت تخریب زیستی در صورت نیاز، علاوه بر زمان مقرر در زمان های میان زمان مقرر نمونه گیری و سنجش صورت می پذیرفت.
تخریب هوازی بیسفنول
محلول بیسفنول به همراه محیط کشت آن تهیه شد. باکتری هایی که مقدم بر تهیه محلول بیسفنول به مدت سه روز زمینه ی رشدشان فراهم شده بود - نگهداری در انکوباتور با دمای - 30°C به محلول اضافه شد و در شیکر و انکوباتور قرار گرفت. این محلول به مدت 10 روز در دستگاه قرار داشت و برای نمونه گیری از دستگاه خارج شده، به زیر هود برده می شد و سپس دوباره نمونه ها داخل دستگاه قرار می گرفتند.
آنالیز
غلظت بیسفنول با دستگاه اسپکتروفوتومتر به روش رنگ سنجی که قبلا در آزمایشگاه برای اندازه گیری غلظت مواد فنولی وجود داشت، اندازه گیری شد. تحت شرایط قلیایی، آمین اولیه ی 4 -آمینو آنتی پایرین با واکنش با ترکیب فنولی باعث به وجود آمدن یک ترکیب میانی می شود که پس از آن با پتاسیم فری سیانید اکسیده شده و رنگ قرمزی را تشکیل می دهد که در طول موج 506 نانومتر جذب خواهد داشت .[9] جذب نسبت به مقدار اولیه ی غلظت بیسفنول در سنجش تاثیرگذار است. سپس نمونه ی تهیه شده برای تعیین غلظت که به آن کاتالیزور و شناساگر اضافه شده را به وسیلهی ورتکس با هم مخلوط کرده تا واکنش همگن و تسریع شود. بعد از 45 دقیقه جذب را در 506 نانومتر خوانده و غلظت بیسفنول را با استفاده از منحنی استانداردی که رسم کرده ایم، می خوانیم. منحنی استاندارد دارای شیب - R2=0.998 - 14/7 با حد اطمینان %95 است.
روش رنگ سنجی
در این مقاله برای سنجش به کار گرفته شده برای تعیین مقدار غلظت بیسفنول، استفاده از روش رنگ سنجی است که با دستگاه اسپکتروفوتومتر کری-150 اجرا شده است. در این روش برای تهیه ی محلول مورد نظر برای شناسایی مقدار باقی مانده ی غلظت بیسفنول پس از تلقیح، نیازمند مخلوط کردن نمونه با مواد شناساگر و حد واسط و کاتالیزور است تا فرآیند سریع تر انجام شده و غلظت مشخص شود. به همراه نمونه، نیاز به محلول -4آمینو آنتی پایرین، پتاسیم فری سیانید و آمونیوم کلراید است. نحوه ی ساخت محلول ها به ترتیب به این گونه است:[
1. محلول بافری: 16/9 گرم از آمونیوم کلراید را در 143 میلی لیتر از غلظت آمونیوم هیدروکسید را مخلوط کرده و با آب مقطر به حجم 250 میلی لیتر می رسانیم.
2. محلول -4آمینوآنتی پایرین: 2 گرم از -4آمینوآنتی پایرین را در آب مقطر حل کرده و به حجم 100 میلی لیتر می رسانیم.
3. محلول پتاسیم فری سیانید: 8 گرم از پتاسیم فری سیانید را در آب مقطر حل کرده و به حجم 100 میلی لیتر می رسانیم.
حال 800 میلی لیتر از محلول نمونه را برمی داریم و با اضافه کردن شناساگر و کاتالیزور به نمونه ی مورد آزمایش و بررسی pH توسط دستگاه باید 10 0/2 باشد. سپس 15 دقیقه صبر نموده تا فرآیندکامل شده حال نمونه را در کوت ریخته و در دستگاه اسپکتروفوتومتر قرار می دهیم و عددی را که دستگاه نشان می دهد را یادداشت می کنیم.
نتایج و بحث
درصد حذف بیسفنول توسط باکتری ر. یوتروفا بر اساس روش نورسنجی در محدوده ی غلظتی 0,5 میلی گرم بر لیتر تا 20 میلی گرم بر لیتر در محدوده ی بین 10 تا 40 درصد بود که هر چه غلظت بیسفنول در محیط بیشتر می شد، درصد تخریب آن نیز افزایش پیدا می کرد. در طول دوران نمونه گیری با مشاهده ی نوسان غلظت بیسفنول در حین تخریب زیستی آن مواجه شدیم. این به دلیل روش سنجش بود. چون در این روش تمامی حلقه های فنولی رنگ می شوند و از آنجاییکه بیسفنول دارای دو ترکیب فنولی است در خواندن آن به وسیله ی روش رنگ سنجی نوسان ایجاد می کند.
همانطور در شکل 1 نشان داده شده است غلظت 13,5 میلی گرم بر لیتر در طی نه روز نمونه گیری توسط باکتری رالستونیا یوتروفا به غلظت 10 میلی گرم بر لیتر رسیده است که درصد تخریب زیستی آن 26% است.
شکل :1 تخریب زیستی بیسفنول توسط باکتری در غلظت های بالا
شکل :2 تخریب زیستی بیسفنول توسط باکتری رالستونیا یوتروفا در غلظت های پایین
همانطور در شکل 2 نشان داده شده است غلظت 1/5 میلی گرم بر لیتر در طی نه روز نمونه گیری توسط باکتری به غلظت 1/2 میلی گرم بر لیتر رسیده است که درصد تخریب زیستی آن 20% است.
نکته ی قابل بررسی دلیل افزایش تخریب زیستی بیسفنول با افزایش غلظت آن است. این احتمال وجود دارد که با افزایش غلظت بیسفنول در محیط شانس شکسته شدن ساختار فنولی در بیسفنول به علت در دسترس قرار گرفتن این حلقه ها به باکتری ر. یوتروفا بیشتر باشد. به عبارت دیگر، احتمال شروع واکنش تخریب زیستی با افزایش غلظت بیسفنول از سمت حلقه های فنولی آن افزایش می یابد. از آن جاییکه احتمال وجود داشت که تعداد باکتری ها در محلول نمونه به خاطر جذب سطحی یکی از موارد افزایش تخریب باشد، آزمایش هایی در همین زمینه انجام پذیرفت که همگی نشان دادند که جذب سطحی بیسفنول بر روی باکتری ر. یوتروفا صورت نمی پذیرد و تمام تخریب های زیستی صورت گرفته به علت انجام فرآیندهای زیستی ریزاندامگان با آلاینده است.
نمونه های گرفته شده از آزمایش های صورت گرفته که به مدت 9 روز به طول انجامید در ساعات معینی در روز جمع آوری می شدند. یکی از فرضیاتی که باعث می شود باکتری ر. یوتروفا توانایی حذف با درصد بالای بیسفنول را نداشته باشد ساختار پیچیده و شکسته نشدن شاخه های این ترکیب است که اجازه نمی دهد ترکیب کربن خود را آزاد کرده و باکتری از آن به عنوان منبع تغذیه خود استفاده کند.
