بخشی از مقاله
علفکش 2و-4 دي کلروفنوکسی استیک اسید - 2,4-D - از گروه کلروفنوکسی آلکانواتها بوده و بطور گسترده براي نابود کردن علفهاي هرز استفاده میشود. برخی باکتريهاي خاك که داراي ژنهاي تجزیه کننده 2,4-D شامل tfdA-F بر روي یک پلاسمید کانژوگاتیو هستند، قادر به تجزیه این علفکش میباشند. اما در مورد حفظ توالی این ژنها و نیز پایداري و انتقال پلاسمید در سیستم بیوفیلم طبیعی، اطلاعات کمی در دسترس است . هدف این تحقیق بررسی افزایش تجزیه 2,4-D توسط باکتري B. hospita در سیستم بیوفیلم و نیز مقایسه افزایش بیان ژن tfdA در سلولهاي بیوفیلم و پلانکتونیک بود. باکتري داراي پلاسمید تجزیه کننده 2,4-D از جمله B. hospita MM1720 که از خاك آلوده به 2,4-D جداسازي شده بود، در محیط کشت حداقل حاوي 2,4-D رشد داده شد. سپس کشت یک شبه باکتري به سیستم فلوسل منتقل شد. تشکیل بیوفیلم و توسعه آن روي سطوح شیشهاي فلوسل به کمک میکروسکوپ عکس برداري و بر اساس مقدار درصد پوشش سطح، اندازهگیري شد. تجزیه 2,4-D نیز با سنجش یون کلرید آزاد شده در طی رشد، اندازهگیري شد. همچنین بیان ژن tfdA در بیوفیلم و سلولهاي پلانکتونیک به کمک PCR کمی، سنجیده شد. نتایج نشان داد که باکتري MM1720 به سطح شیشه چسبیده و بیوفیلم با موفقیت توسعه یافت. تجزیه علف کش در بیوفیلم نسبت به سلولهاي پلانکتونیک، با سرعت بیشتري انجام شد. همچنین افزایش بیان ژن tfdA باکتري Burkholderia در بیوفیلم نشان داده شد. به علاوه بیان بیشتر ژن tfdA در B. hospita MM1720 به ترتیب در سلولهاي بیوفیلم و پلانکتونیک به مقدار 12/41 و 8/59 کپی از tfdA mRNA در هر سلول، اندازهگیري شد. نتایج این تحقیق نشان میدهد که بیان ژنهاي تجزیه کننده 2,4-D در سیستم بیوفیلم افزایش چشمگیري داشته و در نتیجه باعث افزایش سرعت تجزیه این سم شده است. بنابراین سیستم بیوفیلم نقش مهمی در تجزیه زیستی ترکیبات سخت تجزیه شونده در کشاورزي و صنایع بیوتکنولوژي ایفا میکند.
علفکشهاي گروه کلروفنوکسی آلکانوئیک اسید نظیر 2و-4 دي کلروفنوکسی استیک اسید - 2,4-D - بطور گسترده براي نابود کردن گیاهان هرز در سرتاسر جهان استفاده میشود . ماندگاري و انباشته شدن این سموم در طبیعت باعث بروز مشکلات جدي در سلامت انسان و محیط زیست میشود. اما برخی از میکروارگانیسمهاي خاك قادر به تجزیه زیستی این علفکشها میباشند. در کاتابولیسم میکروبی 2,4-D ، ژنهاي تجزیه کننده شامل ژنهاي tfdA-F که عموما توسط پلاسمیدها حمل میشوند، دخالت دارند. این پلاسمیدها از نظر اندازه بزرگ و از نظر تعداد نسخه در باکتري، کم هستند .اغلب باکتريها در محیطهاي طبیعی یا مصنوعی با ایجاد بیوفیلم به سطوح مختلف میچسبند و در نتیجه رویداد انتقال ژن میان باکتريها افزایش مییابد. تحقیقات اخیر نشان داد که بیوفیلم، یک محیط ایدهآل براي انتقال افقی ژنها میباشد . - 4 - همچنین سیستم بیوفیلم مخصوصا براي ترکیبات سخت تجزیه شونده، بسیار مناسب است. زیرا تعداد زیاد باکتريها در بیوفیلم و نیز توانایی بالاي آنها در تثبیت این ترکیبات، موجب افزایش سرعت تجزیه این ترکیبات شیمیایی میشود. از طرفی، تجزیه زیستی با افزایش انتقال ژنهاي کاتابولیکی در میان ارگانیسمهاي بیوفیلم و نیز با افزایش دسترسی سموم براي تجزیه در اثر شیمیوتاکسی باکتریایی، تسهیل میشود . - 7 - اگرچه ارتباط مشخصی میان انتقال افقی پلاسمید و افزایش سرعت تجزیه ترکیبات آلی سمی توسط باکتريها، تعیین نشده است اما درك پایداري و انتقال پلاسمیدهاي تجزیه کننده در سیستم بیوفیلم اهمیت زیادي دارد . - 5 - اختلافات فیزیولوژیکی میان باکتريها در حالتهاي بیوفیلم و پلانکتونیک در اثر وجود اختلاف عمده در بیان ژن، ایجاد میشود . - 3 - لذا استفاده از روش PCR کمی1 جهت بررسی بیان ژن tfdA - به عنوان فعالیت تجزیه کنندگی باکتري - در طی تجزیه سم 2,4-D و در حالتهاي بیوفیلم و پلانکتونیک، مناسب میباشد . سویههاي مختلفی از باکتري Burkholderia براي حذف ترکیبات شیمیایی سخت تجزیه شونده در صنایع بیوتکنولوژي و کشاورزي، مورد توجه قرار گرفتند - . - 6 در این تحقیق، از باکتريB. hospita MM1720 که از خاك آلوده به علف کش 2,4-D ، جداسازي شده بود براي بررسی سرعت تجزیه زیستی و نیز ارزیابی کمی بیان ژن موثر در تجزیه کنندگی 2,4-D در سیستم بیوفیلم و پلانکتونیک استفاده شد.
مواد و روشها
باکتري، محیط کشت و سنجش تجزیه :2,4-D باکتري B. hospita MM1720 - pMM172 - که از خاك آلوده به 2,4-D جداسازي شده بود در محیط پایه معدنی حاوي 1/14 gL-1 از محلول استریل 2,4-D به عنوان تنها منبع کربن و انرژي، رشد داده شد . - 10 - همچنین براي رشد باکتريهاي Ralstonia eutropha JMP134 - pJP4 - و نیز R. eutropha JMP222 و B. hospita MM1725 به عنوان شاهد مثبت و منفی از محیط کشت 2,4-D و یا R2A استفاده شد . - 1 - باکتريها در انکوباتور شیکردار با دماي 28 °C و 100 rpm رشد داده شدند. تجزیه 2,4-D از طریق مقدار یون کلرید آزاد شده در محیط رشد و با استفاده از دستگاه سنجش کلرید Sherwood 926، اندازهگیري شد .
سیستم فلوسل2 و تشکیل بیوفیلم: پس از ارزیابی اولیه ایجاد بیوفیلم توسط باکتري B. hospita بر صفحات شیشهاي، سیستم فلوسل براي ایجاد بیوفیلم استفاده شد . - 9 - محیط کشت 2,4-D یا R2A که با یک درصد از کشت شبانه هر باکتري تلقیح شده بود، توسط پمپ پریستالتیک از لولههاي شیشهاي ویژهاي عبور داده شد. تشکیل و توسعه بیوفیلم در هر دو سطح بالا و پایین لولههاي فلوسل، توسط میکروسکوپ نوري Leica که با یک دوربین CCD مجهز بود، تصویر برداري شد. تشکیل و توسعه بیوفیلم با محاسبه درصد پوشش سطح در فلوسل به کمک نرم افزار Scion VG-5 PCI، اندازهگیري شد.سنجش کمی بیان ژن tfdA در باکتريهاي سیستم بیوفیلم و پلانکتونیک: بیان ژن tfdA در سلولهاي بیوفیلم و پلانکتونیک به کمک PCR کمی سنجیده شد . - 2 - پس از پایان دوره رشد، سلولهاي پلانکتونیک و بیوفیلم از سیستم فلوسل جمعآوري شد و RNA کل با دقت و به کمک RNeasy Mini Kit - Qiagen GmbH - جداسازي شد. cDNA، پس از تیمار با DNase، بلافاصله به کمک ThermoScript RT-PCR System، ایجاد شد. PCR کمی به کمک MJ Mini Thermal Cycler - Bio-Rad - انجام شد . پرایمرهاي مورد نیاز به کمک نرم افزار Primer3 طراحی شد و توسط شرکت MWG آلمان ساخته شد. همچنین سنجش کمی بیان ژن tfdA بر اساس تعداد نسخههاي tfdA RNA در هر باکتري، اندازهگیري شد.
نتایج و بحث
نتایج نشان داد که باکتري B. hospita MM1720 توانایی تشکیل بیوفیلم بر روي سطوح شیشهاي فلوسل را داشت. بهطوريکه درصد پوشش سطح فلوسل با بیوفیلم پس از 9 روز، از % 0/125 به % 22/636 افزایش یافت. این نتایج به وضوح تشکیل موفقیتآمیز بیوفیلم و توسعه آن را هنگام استفاده از محیط کشت فقیر از کربن و انرژي 2,4-D، نشان داد. اگر چه بیوفیلم تشکیل شده هنگام رشد در محیط کشت غنی R2A، ضخیمتر بود. همچنین نتایج حاصل از سنجش تجزیه 2,4-D، همبستگی بین سرعت تجزیه این سم و توسعه بیوفیلم را نشان داد . - R2=0/9372 - سرعت تجزیه 2,4-D در هر دو فاز رشد بیوفیلم و رشد پلانکتونیک، نیز اندازهگیري شد - جدول . - 1 سرعت بیشتر تجزیه 2,4-D توسط باکتري MM1720 در فاز رشد بیوفیلم نشان داد که سرعت تجزیه 2,4-D در بیوفیلم معادل % 32 بیشتر از سرعت تجزیه این سم در فاز رشد پلانکتونیک بود.
با توجه به فرضیه وجود اختلافات فیزیولوژیکی بین باکتريهاي فرم بیوفیلم و پلانکتونیک به دلیل اختلاف در بیان ژنها، روش PCR کمی براي سنجش بیان ژن tfdA استفاده شد. نتایج از افزایش مشخص بیان ژن tfdA در سیستم بیوفیلم در مقایسه با سلولهاي پلانکتونیک، دلالت داشت - شکل . - 1 بیان 12/41 و 5/89 نسخه از tfdA mRNA در هر سلول باکتري به ترتیب در فرم بیوفیلم و پلانکتونیک، میزان بالاي بیان ژن tfdA را در باکتري B. hospita MM1720 نشان داد. همچنین بررسی آماري نتایج حاصل در شکل 1، مبنی بر بیشتر بودن میزان بیان ژن تجزیه کننده 2,4-D در باکتري MM1720 نسبت به باکتري استاندارد تجزیه کننده این علفکش یعنی R. eutropha JMP134 را تایید کرد . - P<0.05 by t-test -
اگرچه تاکنون گزارشی در خصوص ارتباط مستقیم میان بیان ژن موثر در تجزیه این سم و سنجش فعالیت تجزیه کنندگی در سیستم بیوفیلم ارائه نشده است اما نتایج این تحقیق نشان میدهد که بیان ژنهاي تجزیه کننده 2,4-D در سیستم بیوفیلم افزایش چشمگیري داشته و در نتیجه باعث افزایش سرعت تجزیه این سم شده است. از آنجا که بیشتر باکتريها در طبیعت به سطوح مختلف میچسبند و ایجاد بیوفیلم میکنند، نتایج این تحقیق نشان میدهد که سیستم بیوفیلم، به ویژه براي حذف ترکیبات سخت تجزیه شونده بسیار مناسب است. بنابراین براي حذف سم 2,4-D در خاكهاي آلوده به این سم، استفاده از باکتريها نظیر B. hospita MM1720 که توانایی ایجاد بیوفیلم را دارند، بسیار مناسب است. همچنین بکارگیري باکتريها به صورت بیوفیلم در تصفیه پساب کارخانجات تولید کننده ترکیبات شیمیایی سخت تجزیه شونده، توصیه میشود.
