بخشی از مقاله
چکیده
به منظور دستیابی به برنج تراریخته مقاوم به آفات که فاقد ژن نشانگر انتخابی باشد، پلاسمید puBC حامل ژن cry1A - c - و فاقد ژن مارکر انتخابی به همراه پلاسمید pTRA132 دارای ژن مقاومت به هیگرومایسین به عنوان نشانگر انتخابی به منظور بهرهگیری از روش تراریزش توأم - - Co-transformation در گیاه استفاده شدند. پلاسمیدها به کالوس های جنینزایی که از بذور رسیده منشا گرفته و دارای توان تقسیم سلولی و باززایی بالایی بودند، به روش ریزپرتابه وارد شدند.
سلولهای تراریخته احتمالی از بافتهای بمباران شده پس از 3 دوره گزینش در محیط کالوسزایی N6 حاوی 50 میلیگرم در لیتر هیگرومایسین B شناسایی شدند. در آخر، کالوسهای مقاوم به هیگرومایسین در محیط باززایی MS حاوی50 میلیگرم در لیتر هیگرومایسین B باززا شدند. در نهایت گیاهان تراریخته احتمالی حاصل با آنالیزهای PCR ، آنالیز مولکولی سادرن و RT-PCR مورد بررسی قرار گرفتند. این آنالیزها نشان داد که چند گیاه تراریخته احتمالی حامل هردو ژن cry1A - c - و ژن مارکر - - hph بودند. برای تشخیص توانایی این ژن ها در کنترل کرم ساقه خوار، نیازمند آنالیزهای دیگری همچون آنالیز وسترن و و زیست سازگاری می باشد.
1؛1مقدمه - منضم به مرور منابع -
برنج به عنوان یکی از مهمترین منابع غذایی مردم جهان با مشکلات زیادی از قبیل تنشهای زیستی و غیرزیستی روبروست. در این بین خسارت عوامل زیستی شامل آفات و بیماریها و علفهای هرز از 24 تا 41 درصد متغیر است
کرم ساقهخوار نواری برنجٌ به عنوان گونهای مهم، آفت اصلی برنج در ایران میباشد که سالیانه خسارت زیادی در شالیزارهای برنج ایجاد میکند؛ خسارت زیاد این آفت، مصرف بیرویه سموم شیمیایی علیه این آفت را به دنبال دارد. مصرف بیرویه سموم دفع آفاتنباتی در چند دهه اخیر، علاوه بر مقاومت حشرات به سموم مصرفشده که نتیجه آن طغیان آفت بوده، موجب صدمات زیست محیطی در جهان نیز گردیده است.
برنج، گیاهی تکلپهای است که بیشترین دستورزی ژنتیکی روی آن انجام شده و بهدلیل داشتن ژنوم کوچکش 4/2×108 - جفت باز - ، دسترسبودن نقشه ژنتیکی کامل و توالی کل ژنوم آن،بهعنوان یک سیستم مدل برای تحقیقات ژنومی غلات محسوب میشود.
شو و همکاران [3] برنج رقم KMD1 را با ژن cry1Ab تراریخته کردند. هنگامیکه لاروهای 8 آفت مهم پروانهای برنج از برگهای برنج تراریخته تغذیه کردند میزان مرگومیر صد درصد بود.
هر چند که نخستین برنج تراریخته جهان در ایران تولید و رهاسازی شده است [4]، اما این برنج تراریخته تنها حاوی یک ژن مقاومت در سه نسخه است. وجود سه نسخه از این ژن در گیاه تراریخته به خودی خود ریسک خاموش شدن ژن را به وجود میآورد. گذشته از این موضوع، گیاه تراریختهای که برای مقاومت به یک آفت گیاهی مورد دستورزی قرار گرفته است، حداقل باید دارای دو ژن متفاوت باشد تا مقاومت مطمئنی به وجود آید و ریسک شکسته شدن مقاومت توسط آفت به حداقل برسد
از سویی دیگر، نشانگرهای مقاومت به آنتیبیوتیکها و علفکشها برای تکثیر انتخابی سلولها و بافتهای تراریخته ضروری میباشد. ولی باقیماندن این نشانگرها در گیاهان تراریخته لزومی ندارد. امروزه روشهایی وجود دارد تا این ژنهای نشانگر را از گیاه، حذف نمود. یکی از این روشها تراریزش توأم به عنوان روشی مؤثر و ساده برای حذف ژن نشانگر انتخابی است. از نظر تئوری، تراریزش توأم ژن اصلی و ژن نشانگر، پس از یکنسل تفرق صفات، موجب تولید گیاهان تراریختهای عاری از ژن نشانگر میشود.
در استفاده از نانوذرات طلا بدلیل کوچکبودن اندازه ذرات، سلول آسیب کمتری دیده و در ضمن تعداد پلاسمیدهای چسبیده روی این ذرات کمتر شده و تعداد پلاسمیدهای وارد شده در سلول و در نتیجه تعداد نسخههای ژنی وارد شده در سلول کمتر میشود که در نتیجه احتمال خاموشی ژن نیز کاهش مییابد.
بنابراین بهدف این مطالعه، انتقال ژن cry1A - C - به گیاه برنج - رقم هاشمی - ، با استفاده از سیستم تفنگژنی، نانوذرات طلا و تراریزش توام دو پلاسمید که اولی حاوی ژن موردنظر و دیگری دارای ژن مقاومت به آنتیبیوتیک هیگرومایسین است، انتقال دهیم تا دو پلاسمید به کار رفته در این فرایند در دو نقطه متفاوت از ژنوم داخل شوند و بدینطریق، بتوان ژن مقاومت به آنتیبیوتیک را پس از یک نسل خودگشنی از ژن cry1A - C - جدا و گیاهان عاری از توالیهای ناخواسته و ژن نشانگر انتخابی تولید نمود.
-2 مواد و روشها
2؛-1 مواد گیاهی و کشت بافت:
در این مطالعه از بذور بالغ پوستگیریشدهی رقم هاشمی برنج به عنوان ریز نمونه، در محیط این-ویترو برای انتقال ژن استفاده شد.
محیط کشت [7] N6 به عنوان محیط کشت کالوسزایی مورد استفاده قرار گرفت. ظروف پتری بذور کشتشده در اتاق رشد تاریک در دمای 25 درجه به مدت 5 - 6 هفته قرار داده شدند.
2؛-2 ناقلهای پلاسمیدی:
در این مطالعه، ناقلهای پلاسمیدی puBC و pTRA132 - شکل - 2-1 برای استفاده مستقیم در روش تراریزش توأم در روش بایولیستیک مورد استفاده قرار گرفتند.
شکل 2-1 نقشه فیزیکی پلاسمیدهای puBC و .pTRA132
2؛-3 انتقال ژن و تولید و انتخاب گیاهان تراریخته:
برای انجام تراریزش به روش تفنگ ژنی، کالوسهای جنینزا در مرکز ظروف پتری به قطر تقریبی 1/5 سانتیمتر به صورت کاملا متراکم جمعآوری شدند.
ذرات طلا با مقدار 10 میکروگرم از هر پلاسمید cry1A - c - - و - pTRA132 به صورت همزمان پوششدهی شد. بعد از 8-7 هفته، کالوسهایکاملاً سفید، ترد و تازه به محیط کشت باززایی MS تغییریافته [9] حاوی 50 میلیگرم در لیتر هیگرومایسین ب منتقل شدند و تا زمان ظهور گیاهچهها و اتمام ریشهزایی در آنها در همین محیط قرار گرفتند. این پتریها در شرایط نوری 16 ساعته و دمای 18/25 برای روز/شب نگهداری میشدند تا گیاهچههای تراریختهی احتمالی ظاهر شوند.سپس گیاهچهها به جعبههای حاوی محیط آبی یوشیدا منتقل شده و درون همان اطاقکهای رشد تا زمان انجام آنالیزهای مولکولی مورد نیاز و بذرگیری از آنها، در شرایط گلخانه نگهداری شدند.
