بخشی از مقاله
چکیده
در روشهاي کلاسیک انتقال ژن به گیاهان، عموما از تکنیک هاي ﳐتلف کشت بافت گیاهی استفاده می شود. استفاده از فنون کشت بافت، فرایند انتقال ژن به گیاهان را با مشکلات متعددي ﳘچون صرف زمان و هزینه زیاد، نیاز به مهارت، ﲣصص و ﲡربه، و بروز تغیﲑات ژنتیکی ناشی از تنوع سوماتیکی، مواجه ساخته است. ازاینرو در سال هاي اخﲑ، ﳏققان به ابداع روشهاي تسهیل شده انتقال ژن اهتمام ورزیدهاند که بی نیاز از فرایند کشت بافت بوده و پاسخگوي نیازهاي ﲢقیقات نوین بیولوژي مولکوﱄ باشند. در این بﲔ، روش غوطهوري گل در سوسپانسیون آگروباکﱰیوم، توجه زیادي را به خود معطوف داشته است. در این ﲢقیق با هدف دستیابی به مهارت انتقال ژن از طریق روش غوطه وري گل و استفاده از آن در ﲢقیقات آتی، گیاه مدل آرابیدوپسیس مورد آزمایش قرار گرفت. گل آذین گیاهان آرابیدوپسیس واریته کلمبیا در مراحل اولیه گلدهی در سوسپانسیون باکﱰي Agrobacterium tumefaciens سویه C58 حامل پلاﲰید ناقل دوگانه pBI121 غوطه ور شد. پس از گزینش بذور حاصل از گیاهان تیمار شده، گیاهان ترارﳜته آرابیدوپسیس بیان کننده ژن گزارشگر GUS با استفاده از تست هیستوشیمیایی X-Gluc و واکنش PCR تائید شدند.
واژههاي کلیدي: آرابیدوپسیس، Agrobacterium tumefaciens، انتقال ژن، غوطهوري گل.
مقدمه
در سالهاي اخﲑ، روش هاي تسهیل شده انتقال ژن که بی نیاز از فرایند کشت بافت می باشند، مورد توجه ﳏققان مهندسی ژنتیک قرار گرفته اند. روشهاي تراریزش بی نیاز از مراحل آشت بافت را روش هاي تراریزش in planta می نامند. روشهاي انتقال ژن in planta در آغاز راه خود قرار دارند. در چند ساﱄ که از مطرح شدن این روشها میگذرد، غالبا از گیاه مدل آرابیدوپسیس استفاده شده است و گزارشات آمی از آاربرد موفقیتآمیز آهنا در گیاهان زراعی در دسﱰس میباشد. با اینحال، ﲢقیقات متعددي براي گسﱰش کاربرد این روش ها در حال اﳒام است . موفقیتهایی که اخﲑا در استفاده از این روشها براي تعدادي از گیاهان زراعی از ﲨله آلزا، یوﳒه، تربچه و سیب زمیﲏ بدست آمده است، آینده نویدﲞشی را فرا رو قرار داده است 4 - ، 6، . - 7
گیاه آرابیدوپسیس بعنوان گیاه مدل در ﲢقیقات بیولوژي مولکوﱄ، این امکان را به ﳏققان می دهد که فرضیه هاي خود را بسرعت و به ﳓو موثر در یک سیستم مدل مطمئن بررسی ﳕایند. روشهاي تسهیل شده ﳐتلفی براي انتقال ژن به آرابیدوپسیس ابداع شدهاند که در این بﲔ، دو روش نفوذپذیري با مکش - 1 - 2 و غوطه وري گل - 3 - بیشﱰین توجه را به خود معطوف داشته اند. در این ﲢقیق با هدف دستیابی به دستورالعمل کاربردي انتقال ژن به روش غوطه وري گل، اقدام به تراریزش گیاه آرابیدوپسیس شد. تولید آرابیدوپسیس ترارﳜته از طریق روش غوطهوري گل با دو هدف اﳒام گرفته است. ﳔست، در اختیار داشﱳ دستورالعمل کاربردي الگو براي کار در دیگر گونههاي گیاهی، و دیگر استفاده از این روش در گیاه آرابیدوپسیس بعنوان مدل ساده ﲢقیقات انتقال ژن به گیاهان.
مواد و روش ها مواد گیاهی، ساختار ژنی و سویه باکﱰی مورد استفاده
جوانهزنی بذور آرابیدوپسیس واریته کلمبیا پس از اسﱰیلیزاسیون سطحی در سطح کاغذ صافی اسﱰیل یا ﳏیط آشت < MS اﳒام شد و گیاهچهها در مرحله چهار برگی به خاک انتقال داده شدند. از پلاﲰید ناقل دوگانه pBI121 حامل ژن گزارشگر گیاهی بتاگلوکورونیدار - GUS - و ژن نشانگر گزینشگر گیاهی و باکﱰیایی نئومایسﲔ فسفوترانسفراز - nptII - آه مقاومت به آنﱵبیوتیک آانامایسﲔ را آد میآند، استفاده شد.
ﲥیه سوسپانسیون باکﱰیایی و غوطهوری گلهای آرابیدوپسیس سوسپانسیون باکﱰي آگروباکﱰیوم در ﳏیط کشت بافت گیاهی < MS حاوی 5 درصد ساکاروز، 44 نانومول BAP و 0/02 درصد سورفکتانت Silwet L-77 با pH= 5/2- 5/7 براي تلقیح گیاهان استفاده شد. گیاهان حامل گلآذین در مراحل اولیه گلدهی ﲟدت 5 تا 30 ثانیه به صورت وارونه درون بشر حاوی سوسپانسیون باکﱰی قرار داده شدند، بطوریکه گل آذین آهنا بطور کامل درون ﳏلول غوطهور شد.
گزینش بذر و تائید گیاهان ترارﳜته
بذور بدست آمده از گیاهان تلقیح شده در سطح ﳏیط کشت گزینش < MS حاوي 20 میلیگرم بر لیﱰ آنﱵبیوتیک کانامایسﲔ کشت داده شدند . گیاهچههایی که اثرات کانامایسﲔ بر روی آهنا کمﱰ مشهود بود انتخاب و به خاک منتقل گردیدند. رنگ آبی ناشی از بیان ژن GUS در مواد گیاهی جدا شده از گیاهان ترارﳜته پس از انکوباسیون در ﳏلول X-Gluc و رنگﱪي کلروفیل بوضوح ﳕایان بود. براي بررسی ماهیت ترارﳜته گیاهانی که تست GUS آهنا مثبت شده بود، از تکنیک PCR بر روي DNA ژنومی آهنا براي تکثﲑ ﲞشی از ژن بتاگلوکورونیداز بطور اختصاصی استفاده شد. براساس مقاله چن و ﳘکاران - 2003 - ، الیگونوکلئوتیدهاي 20 مري با تواﱄ َ– 3 – GATGTGATATCTCCACTTACَ5 و َ– CCCGCTTCGAAACCAATGCC – 3 َ5 براي تکثﲑ قطعهاي به اندازه 1247 bp از ژن GUS طراحی شدند. اندازه باند DNAي تکثﲑ شده در واکنش PCR، در مقایسه با نشانگر اندازه 1 kb DNA ladder تعیﲔ گردید.
نتایج انتخاب گیاهان مقاوم به کانامایسﲔ و تائید گیاهان ترارﳜته
اثر کانامایسﲔ بر گیاهچههاي جوانه زده در سطح ﳏیط کشت گزینش، پس از دو هفته مشاهده گردید. تقریبا به ازاي هر 1000 بذر کشت شده در ﳏیط گزینش 8 تا 10 گیاه زنده انتخاب شدند. پس از اﳒام تست هیستوشیمیایی GUS، به ازاي هر 1000 بذر کشت شده در ﳏیط گزینش، 4 تا 5 گیاهچه رنگ آبی ناشی از بیان ژن گزارشگر بتاگلوکورونیداز را نشان دادند - تصویر . - 1 آغازگرهاي مورد استفاده براي واکنش PCR بنحوي طراحی شدند که قطعهاي از ناحیه انتهایی پروموتور S 35 و ناحیه ابتدایی تواﱄ کد کننده پروتئﲔ GUS در پایﲔدست پروموتور را تکثﲑ ﳕایند. فرآورده هاي PCR پس از الکﱰوفورز بر روي ژل آگاروز، باند 1247 جفت بازي مورد انتظار مرتبط با ژن GUS و پروموتور 35 S آن را در ژنوم گیاهان مورد نظر نشان داد - تصویر . - 2
ﲝث
در این ﲢقیق ژن گزارشگر بتا گلوکورونیداز به آرابیدوپسیس از طریق غوطهوری گل انتقال داده شد و نرخ انتقال ژن 0/4 درصد بدست آمد. نرخ انتقال ژن بدست آمده در این ﲢقیق نسبت به آنچه که در گزارشات مشابه ذکر شده 0/5-3 - درصد - ، پائﲔ است که این امر ﲢت تاثﲑ عوامل ﳐتلفی می باشد. اندازه گیاه و پرورش آن در شرایط ﳏیطی مناسب نقش مهمی در تعداد بذرهاي تشکیل شده دارد. ﳘچنﲔ مرحله رشدي که در آن گیاهان تلقیح میشوند، یکی از مهمﱰین فاکتورها در بدست آوردن نتاج ترارﳜته است . - 3 - علاوه بر این، واریتههاي ﳐتلف آرابیدوپسیس، سویه آگروباکﱰیوم، و شرایط و امکانات آزمایشی نیز اﳘیت زیادی در این زمینه دارند. استفاده از واریته های آرابیدوپسیس جهش یافته نظﲑ CRABS-CLAW که در اثر جهش ﲣمدانشان باز است،
باعث افزایش چند برابری نرخ تراریزش میگردد . - 5 - شرایط آزمایشی نظﲑ نور و رطوبت و ﳘچنﲔ مواد و امکانات آزمایشی بی شک تاثﲑی انکارناپذیر در نتیجه هنایی خواهد داشت. ﲠینه کردن این روش در آزمایشگاه و رساندن درصد ترانسفورماسیون به میزان 0/8 تا 1/5 درصد میتواند به استفاده کاربردی از آن کمک زیادی ﳕاید. تصویر -2 واکنش زﳒﲑه ای پلیمراز برای تایید حضور ژن gus در گیاهان ترارﳜته - چاهکهاي 1، 3 و 6 قطعه تکثﲑ شده مربوط به ژن gus از گیاهان ترارﳜته، چاهک 2 گیاه کنﱰل منفی، چاهک 4 سایزمارآر 1 kb DNA Ladder، چاهک 5 پلاﲰید pBI121 کنﱰل مثبت، چاهک هاي 7 و 8 پلاﲰید pBI121 نوترکیب کنﱰل منفی - .
