بخشی از مقاله
انتقال مکان ژنی Pi5 (حامل ژنهاي مقاومت در برابر بلاست) به برنج با استفاده از تلاقی برگشتی بر اساس انتخاب به کمک نشانگرهاي مولکولی
چکیده
اصلاح ارقام پرعملکرد و مقاوم به تنشهاي محیطی از جمله بیماریها براي افزایش عملکرد در واحد سطح و تامین امنیت غذایی اهمیت بسزایی دارد. بیماري بلاست با عامل بیماريزاي Magnaporthe grisea مهمترین بیماري برنج است که سالانه خسارت زیادي به محصول برنج وارد میکند. مکان ژنی Pi5 در برنج طیف وسیعی از مقاومت به بلاست را ایجاد میکند. این مکان ژنی حامل چندین ژن مقاومت به بلاست میباشد. لذا در این تحقیق تلاش شده مکان ژنی Pi5 در یک برنامه تلاقی برگشتی بر اساس انتخاب به کمک نشانگرهاي مولکولی به لاین تجاري و پرعملکرد ندا در مدت زماناهی نسبتاًانتقال دادهکوت شود. مکان ژنی فوق طی دو برنامه تلاقی برگشتی و دو نسل خودگشنی پس از هر بار تلاقی برگشتی به لاین ندا انتقال.مکانداده ژنیشد
Pi5 در نتاج در حال تفرق با استفاده از نشانگرهاي اختصاصی ردیابی گردید و گزینش پسزمینه بر روي بوتههاي حامل مکان ژنی فوق با استفاده از تعداد زیادي نشانگر SSR با هدف شناسایی بوتههاي حامل سهم بیشتري از ژنوم والد تکراري انجام شد. در نسل BC1 شش بوته حامل مکان ژنی Pi5 شناسایی و یک بوته با شباهت بیشتر به والد تکراري (%92/5) خودگشن گردید. در نسل BC1F2 ده بوته حامل مکان ژنی Pi5 شناسایی و یک بوته با شباهت بیشتر به والد تکراري (%96) با والد تکراري تلاقی برگشتی داده شد. در نسل BC2 هشت بوته حامل مکان ژنی Pi5 شناسایی و یک بوته داراي شباهت بالا به والد تکراري (% 98/5) خودگشن گردید تا نسل BC2F2 بدست آید. مقاومت به بیماري لاین انتخابی در خزانه بلاست مورد ارزیابی قرار گرفت که حاکی از مقاومت این لاین در برابر آلودگی طبیعی و مصنوعی بوده است. نتایج این تحقیق نشان داد که استفاده از نشانگرهاي مولکولی هم براي ردیابی ژن هدف و هم براي بازیابی سریع ژنوم والد تکراري در نتاج تلاقی برگشتی بسیار کارامد است.
واژههاي کلیدي: برنج، مقاومت، بلاست، تلاقی برگشتی، نشانگر.
مقدمه
بهبود خصوصیات کیفی و مکی در برنج و انتقال این خصوصیات به ارقام و لاینهاي الیت اهمیت بالایی دارد. تلاقی برگشتی روشی براي انتقال صفات هدف از لاین بخشنده به لاین گیرنده میباشد. هدف از تکرار تلاقی برگشتی با والد گیرنده، افزایش سهم ژنومی والد گیرنده در نتاج میباشد. دو عیب عمده روش تلاقی برگشتی رایج عبارتند از: الف) نیاز به تعداد زیادي نسل براي بازیابی ژنوم والد تکراري و در نتیجه طولانی بودن زمان لازم براي دستیابی به ژن مورد نطر؛ ب) انتقال همزمان و ناخواسته سایر ژن هاي احاطه کننده ژن مورد نطر از والد بخشنده به والد گیرنده که بهنژادگران هیچ گونه کنترل مستقیمی بر روي اندازه این ناحیه ندارند (سمگان و همکاران، .(2006 براي فائق آمدن بر مشکلات فوق، روش تلاقی برگشتی به کمک نشانگرها (MAB) پیشنهاد شده است که روش مناسبی هم براي انتقال سریع صفت مورد نظر و هم براي بازیابی کامل ژنوم والد تکراري طی تعداد کمی تلاقی برگشتی میباشد. شناسایی نشانگرهاي مولکولی با تفرق همزمان یا با پیوستگی محکم با صفت مورد نظر پیش نیاز مهمی براي موفقیت روش MAB است. بهترین حالت موقعی است که نشانگر مولکولی درست در داخل ژن هدف قرار دارد (سمگان و همکاران، .(2006 بیماري بلاست با عامل بیماريزاي قارچی Magnaporthe grisea یکی از مهمترین بیماريهاي خسارتزا در برنج است که سالانه بیش از 10 میلیون تن عملکرد برنج در دنیا راکاهش می دهد (زیگلر و همکاران، .(1994 استفاده از ارقام مقاوم با ژنهاي مقاومت اصلی (R) هنوز به عنوان یکی از بهترین روش هاي قابل اطمینان جهت کنترل بیماريها می باشد. مقاومت به M. grisea تابع سیستم کلاسیک ژن در مقابل ژن است که ژن اصلی مقاومت R، که در برنج ژن Pi گفته می شود، در جلوگیري از آلودگی نژادهاي مهاجم M. grisea است (فلور 1971؛ سیلو و همکاران، .(1992 مکان ژنی Pi5 در برنج طیف وسیعی از مقاومت به Magnaporthe grisea را ایجاد میکند. این مکان ژنی حامل چندین ژن مقاومت به بلاست میباشد (وانگ و همکاران 1994؛ هان، .(2001 لذا در این تحقیق تلاش شده مکان ژنی Pi5 در یک برنامه تلاقی برگشتی و بر اساس انتخاب به کمک نشانگرهاي مولکولی (MAB)به لاین تجاري ندا در مدت زمان نسبتاً کوتاهی انتقال داده شود.
مواد و روشها
برنامه انتقال مقاومت با تلاقی دو رقم صدري بعنوان دهنده مقاومت به بلاست (حامل مکان ژنی (Pi5 و لاین الیت تجاري ندا بعنوان والد گیرنده در سال 1386 آغاز شد. بوتههاي F1 با والد تکراري ندا تلاقی برگشتی داده شدند تا نسل BC1 بدست آید. یک بوته BC1 حامل ژن Pi5 خودگشن شد تا جمعیت BC1F2 بدست آید. تلاقی برگشتی دوم بین یکی از لاینهاي انتخابی BC1F2 و والد تکراري ندا انجام شد تا نسل BC2 بدست آید. نتاج BC2 خودگشن شدند تا نسل BC2F2 بدست آید . ارزیابی لاین نهایی انتخابی از نطر مقاومت به بلاست در خرداد-تیر 1390 در خزانه بلاست موسسه تحقیقات برنج کشور (معاونت آمل) انجام گردید.
DNA ژنومی کل با استفاده از روش CTAB استخراج شد (سقایی-معروف و همکاران، PCR .(1984 در حجم 10 مایکرولیتر با استفاده از کیت PCR Master Mix (شرکت سیناژن) انجام شد . محصول PCR با الکتروفورز در ژل آگارز %3/5 حاوي نیم میکروگرم بر مایکرولیتر اتیدیوم بروماید انجام شد. عکسبرداري از ژلها با دستگاه GelDoc انجام گردید. از 2 جفت آغازگر اختصاصی ژن Pi5 براي انجام گزینش پیش زمینه (Foreground selection) و ردیابی ژن مقاومت در نتاج BC1، BC1F2 و BC2 استفاده شد. همچنین از 100 نشانگر SSR براي تشخیص وجود پلی مورفیسم میان دو والد و از 33 نشانگر پلی مورف براي انجام گزینش پس زمینه (Background selection ) یعنی ردیابی ژنوم والد تکراري در نتاج BC استفاده شد. ژنوتیپ والد بخشنده بصورت BB، ژنوتیپ والد تکراري بصورت AA و افراد هتروزیگوت بصورت AB امتیازدهی شدند. میزان شباهت افراد نسلهاي BC به والد دوره اي با فرمول محاسبه گردید که در آن Nt تعداد کل لوکوسهاي SSR مورد بررسی، NAB تعداد لوکوس هتروزیگوت و NAA تعداد لوکوس هموزیگوت از نظر آللهاي والد تکراري میباشد.
