بخشی از مقاله
چکیده
عفونت ویروس هپاتیت B دهمین عامل مرگ و میر بالا در سراسر جهان میباشد. مهمترین عامل تشخیصی به منظور بررسی عفونت ویروس هپاتیت B، آنتیژن سطحی هپاتیت B است. بررسی آنتیژن سطحی این ویروس از سال 1967 به عنوان شاخص قابل قبولی در این زمینه از سوی سازمانهای انتقال خون سراسر دنیا پذیرفته شده است. برای تشخیص آنتیژن سطحی هپاتیت B به طور گسترده از روش الایزا استفاده میگردد.
هدف از این مطالعه بهبود تشخیص آنتیژن سطحی هپاتیت B به روش الایزا با بهرهگیری از نانوذرات طلا است. در این روش از نانوذرات طلا به عنوان حاملی برای آنتیبادی آنتی هپاتیت B بیوتینیله - آنتیبادی ثانویه - استفاده گردید، که هدف تمایلی برای استرپتوآویدین- پراکسیداز ترب کوهی میباشد. پس از تشکیل کمپلکس ساندویچ ایمنی بین آنتیبادی تثبیت شده روی کیت و آنتیبادی ثانویه تثبیت شده روی نانوذرات طلا درحضور آنتیژن سطحی هپاتیت B، پراکسیدازهای محبوس در سطح، تترا متیل بنزیدین و آب اکسیژنه را به سیگنال نوری کاتالیز میکند.
تقویت موثر سیگنال توسط الایزا ریدر پلیت محاسبه و تایید شد. نتایج نشان داد که حد تشخیصی روش بررسی شده در مقایسه با روش الایزای معمول بهتر میباشد. سیگنالهای خطی وابسته به غلظت آنتی ژن سطحی هپاتیت B از 0/05 تا 1/75 نانوگرم در هر میلیلیتر در یک نمودار به صورت لگاریتمی بدست آمد که حد تشخیصی 50 پیکوگرم در هر میلیلیتر را نشان داد.
-1 مقدمه
بر اساس گزارشهای سازمان بهداشت جهانی1 بیش از 240 میلیون نفر به عفونت مزمن کبدی ناشی از ویروس هپاتیت B دچار هستند و حدود 600 هزار نفر در هر سال با توجه به پیامدهای حاد یا مزمن این بیماری دچار مرگ میشوند به همین دلیل این بیماری به عنوان مشکل عمده بهداشت جهانی مطرح میشود
در حال حاضر HBV یکی از مشکلات عمده سلامت در کشور ما میباشد و حدود 1/5 میلیون نفر در ایران مبتلا به عفونت HBV میباشند. فرض بر این است که 15 تا 40 درصد از آنها در خطر ابتلا به سیروز 2و یا کارسینوما هپاتوسلولار 3 میباشند. شیوع عفونت HBV در مطالعات اخیر نسبت به مطالعه در 2000-2001 بالاترگزارش شده است
در طی سالهای اخیر روش های تشخیص مختلفی مانند الایزا4، سنجش ایمنی آنزیمی میکروذرات5 وسنجش ایمنی رادیویی6 برای تشخیص ویروسهای مختلف مانند ویروس هپاتیت B درانسان مورد استفاده قرار گرفته اند .[3] تشخیص و پیگیری عفونت ناشی از ویروس HBV به دلیل سنجش و شناسایی پروتئینهای ویروس و آنتیبادیهای ضد آن در سرم یا پلاسما امکان پذیر بوده و تستهای سرولوژیک به روش آنزیم ایمنواسی کاربرد عمومی داشته، جایگزین روش رادیو ایمنواسی شده و به شکل تجاری عرضه میشود. کیتهای مذکور امکان شناسایی پروتئینهای مختلف ویروس را فراهم آورده است . آنتیژن سطحی هپاتیت 7B جزئی از کپسید ویروس است که مقدار بسیار زیاد آن توسط ویروس تولید میشود چنان که ممکن است در جریان گردش خون 1015 ذره ویروس موجود باشد، به همین دلیل به عنوان مناسبترین نشانگر برای شناسایی ویروس هپاتیت B معرفی گردیده است. وجود HBsAg معادل عفونت فعال محسوب میشود
در آزمایشهای ایمنیشناسی یکی از مهمترین مراحل نشاندار کردن آنتیبادیها است. از میان مواد متنوعی که برای نشاندار کردن آنتیبادی ها مورد بررسی قرار گرفته است، آنزیمها به دلیل مزایای منحصر به فرد خود از جمله خطر کمتر و سهولت در به کارگیری بیشتر مورد استفاده قرار میگیرند. در تکنیکهای مختلف نسبت متفاوتی از آنزیم به آنتیبادی ترجیح داده میشود، به طور مثال در تکینیک الایزا نسبت زیاد آنزیم به آنتیبادی مطلوبتر است و سبب بهبود حد تشخیص آنتیژن میگردد . آنزیم پراکسیداز ترب کوهی8 از شناخته شده ترین آنزیمهایی است که درآزمایشهای ایمنی به کار میرود. این آنزیم سوبستراهای متفاوتی دارد که استفاده از آنها مبتنی بر موارد کاربرد آنزیم میباشد
به منظور اتصال تعداد بیشتری آنزیم نشانگر به آنتیبادی و افزایش بازده آنزیم و در نتیجه قویتر شدن سیگنال تولیدی آنزیم و به تبع آن افزایش در حساسیت روش تشخیصی یکی از محبوبترین استراتژیها استفاده از نانوذرات به منظور اتصال آنتی بادی و آنزیم نشانگر بر روی آن میباشد . به طور مثال بررسی به منظور اتصال آنتیبادی ثانویه و آنزیم پراکسیداز ترب کوهی بر روی نانوذرات طلا صورت گرفته است که منجر به بهبود حد تشخیصی آنتیژن کارسینوامبریونیک شده است
امروزه علم نانو و زیستفناوری توانستهاند مسیرهای نوینی را در زیست فناوری و پزشکی پیدا کنند. در سال 2010 تولید نانو مواد مهندسی شده مورد استفاده در زمینه زیستفناوری به بیش از یک تریلیون واحد در سال رسید و پیش بینی شده تا سال 2020 به بیش از ده تریلیون در سال برسد. در این راستا استفاده از ترکیبات نانویی متعددی در طراحی روشهای تشخیصی پیشنهاد شده است
نانوساختارها دارای ویژگیهای مغناطیسی، نوری، شیمیایی و ساختاری خاصی هستند که آنها را به ابزارهای تشخیصی مناسب تبدیل میکند
اتصال آنتیبادی به نانو ذرات منجر میشود که ویژگیهای نانو ذرات با ویژگی اختصاصی بودن و قدرت تشخیص آنتیبادی در کنار هم قرار بگیرند به گونهای که آنتیبادیهای متصل شده به نانو ذرات به یکی از مهمترین ابزارهای زیستی در زمینه تشخیص و درمان اختصاصی بیماریها تبدیل شدهاند
با توجه به موارد فوق در این مقاله، بهبود حد تشخیص آنتیژن سطحی هپاتیت B مورد بررسی قرار گرفت. به این منظور، استراتژی افزایش پیک آنزیم پراکسیداز ترب کوهی با استفاده از نانوذرات طلا مورد آزمایش قرار گرفت که تا به حال در پژوهش دیگری بررسی نگردیده است. در این روش ابتدا کمپلکس نانوذرات طلا- آنتیبادی آنتیهپاتیت -B پراکسیداز آماده و در مرحله بعد به منظور تشکیل کمپلکس ساندویچ ایمنی به آنتیبادی اولیه - آنتیژن سطحی هپاتیت B اضافه گردید. سیگنال نوری حاصل از کاتالیز سوبسترا توسط آنزیم پراکسیداز به وسیله دستگاه الایزا ریدر مورد بررسی قرار گرفت. کل مراحل انجام شده به صورت شماتیک در شکل - 1 - نشان داده شده است. درگام بعدی رابطه خطی بین سیگنال تولیدی و غلظت آنتیژن سطحی هپاتیت B در روش طراحی شده و روش معمول الایزا - بدون افزایش پیک آنزیمی - مقایسه گردید و نمودار مربوطه و حد تشخیصی هر دو روش مورد ارزیابی قرار گرفت.
شکل - : - 1 مراحل کلی پژوهش انجام شده به صورت شماتیک
-2 مواد و روشها
-1-2 مواد و تجیهزات
در این پژوهش، سرم آلبومین گاوی و نانوذرات طلا با قطر 50 نانومتر از کمپانی سیگما خریداری شد. مواد اصلی این پژوهش شامل: آنتیبادی آنتیهپاتیت B بیوتینیله، آنتیژن سطحی هپاتیت B زیرنوع ay و ad و محتویات کیت HBsAg با همکاری شرکت پیشتازطب تهیه گردید. سایر مواد لازم برای ساخت بافرها از کمپانیهای معتبر خریداری شد.
-2-2 روش آزمایش
-1-2-2 ساخت کمپلکس نانوذرات طلا- آنتیبادی آنتیهپاتیت -B پراکسیداز
ابتدا pH سوسپانسیون نانوذارت طلا به منظور آماده سازی با کمک NaOH نیم مولار روی 9 تنظیم گردید 8] و.[12 سپس مقدار معینی از محلول حاوی آنتیبادی بیوتینیله با غلظت 2/7 میلیگرم در هر میلی لیتر به 1 میلیلیتر سوسپانسیون طلا اضافه گردیده و بعد از آن به مدت یک ساعت بر روی شیکر با سرعت پایین و در دمای محیط قرار داده شد. سپس به منظور جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی BSA 2 درصد به آن اضافه گردید. آنتیبادیهای بیوتینیله اتصال یافته با نانو ذارت طلا به کمک سانتریفیوژ با سرعت 10650g به مدت 10 دقیقه جدا و شستشو گردید. سپس کمپلکس جدا شده در مجاورت با استرپتوآویدین- پراکسیداز به غلظت 1 میلیگرم در هر میلیلیتر به مدت 2 ساعت در دمای محیط قرار گرفت. مراحل شستشو دوباره تکرار و بعد از آن کمپلکس حاصل در محلول BSA یک درصد و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگه داری شد.
-2-2-2 به دام افتادن آنتیژن توسط آنتیبادی اولیه
در این مرحله 100 میکرولیتر از بافر PBS حاوی HBsAg در غلظت های متفاوت به هر چاهک کیت پوشیده شده با آنتیبادی اولیه افزوده گردید. این مرحله در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه انجام شد. در پایان به منظور جداسازی آنتیژنهای اتصال نیافته هر چاهک سه مرتبه به کمک بافر شستشو حاوی PBS با 0/05 درصد توئین شسشتو گردید.
-3-2-2 تشخیص HBsAg
به منظور شناسایی و آنالیز HBsAg بعد از به دام افتادن آنتیژن توسط آنتیبادی اولیه کوت شده در ته چاهک کیت، 100 میکرولیتر از کمپلکس نانوذرات طلا- آنتیبادی آنتیهپاتیت -B پراکسیداز به چاهک اضافه گردید و برای مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد. سپس هر چاهک 5 بار با بافر شستشو، شسته شد. در مرحله بعد 100 میکرولیتر تترا متیل بنزیدین و آب اکسیژنه به عنوان سوبسترای رنگزا به هر چاهک اضافه و به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق و تاریکی قرار داده شد. با اضافه کردن 50 میکرولیتر اسیدکلریدریک 1 نرمال به عنوان متوقف کننده فعالیت آنزیم به هر چاهک، ادامه واکنشهای آنزیمی متوقف گردید. برای سنجش جذب نوری هر چاهک از دستگاه الایزا ریدر با فیلتر 450 نانومتر و فیلتر 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرنس استفاده شد.
