بخشی از مقاله
پنجمﲔ ﳘایش ملی بیوتکنولوژي ﲨهوري اسلامی ایران 3-5 آذر ماه 1386، سالن اجلاس سرا
جستجو و شناسائی آنتی ژهنای هدف جدید در بیماری هپاتیت اتواﳝیون
سودابه اکﱪزاده شعرباف1*، بابک نﲑ نوری2، ﳏمدرضا زالی2، ﲠروز وزیری1** -1 انستیتو پاستور ایران، ﲞش بیوتکنولوژی، آزمایشگاه پروتئﲔ- شیمی -2 دانشگاه علوم پزشکی شهید ﲠشتی، مرکز ﲢقیقات کبد و گوارش
چکیده:
شناسائی مارکرهای مناسب برای تشخیص سرولوژیکی بیماری هپاتیت اتواﳝیون دارای اﳘیت کلیدی است و مانع از بکار بسﱳ روشهای تشخیصی ﲥاﲨی مثل بیوپسی بافت کبد می گردد. ﲢقیق حاضر بااستفاده از ترکیب الکﱰوفورز دوبعدی و وسﱰن بلاتینگ برای یافﱳ اهداف جدید آنتی ژنی قابل شناسائی توسط اتوآنتی بادیهای تولید شده در بیماری هپاتیت اتواﳝیون نوعI صورت پذیرفت. آنالیز بلات های متفاوت بدست آمده از ﳕونه های بیمار و کنﱰل، چهار اسپات پروتئینی را ﳕایان ساخت که با فراوانی بالا در ﳕونه های بیمار مشاهده می شدند، اسپات های پروتئینی متناظر با هر بلات بر روی یک عدد ژل رنگ آمیزی شده با کوماسی کلوئیدال شناسائی، جداسازی و بوسیله طیف سنجی جرمی تعیﲔ هویت گشت. در این ﲢقیق ما موفق به
شناسائی دو آنتی بادی بر علیه دو ایزوفورم ﳐتلف از پروتئﲔ آلبومﲔ گردیدﱘ و بعلاوه اورپروداکشن یک آنتی بادی جدید بر علیه پروتئﲔ BiP و آنتی بادی دیگری بر علیه پروتئﲔ شوک حرارتی 60kDa - Hsp 60 - در سرم های بیمار مشاهده شد.
مقدمه:
هپاتیت اتواﳝیون یک بیماری ارثی است که در آن سیستم اﳝنی شروع به ﲣریب بافت های کبدی می ﳕاید. شناسایی این بیماری در مراحل اولیه از نظر بالینی و انتخاب نوع درمان حائز اﳘیت بسیار است و مانع از استفاده از اقدامات اساسی مانند پیوند بافت کبدی می گردد. تاکنون پروتئﲔ های ﳐتلفی شناخته شده اند که بعنوان آنتی ژن، مورد شناسایی اتوآنتی بادی های اختصاصی تولید شده در این بیماری قرار می گﲑند. سه عدد از مهمﱰین این پروتئﲔ ها که بنام های آاتالاز، -α انولاز و لاکتوفرین خوانده می شوند، هدف اساسی آنتی بادیهای سیتوپلاﲰی آنتی نوتروفیل - ANCA - می باشند. یک پروتئﲔ که جدیدتر شناخته شد ه بنام ریبونوکلئوپروتئﲔ هسته ای هﱰوژنوس A2/B 1 توسط آنتی بادی آنتی نوکلئار شناسایی می گردد. حضور این پروتئﲔ ها که به انواع روشهای آزمایشگاهی اﳝنوفلورسانس، الایزا و اﳝنودتکشن با وسﱰن بلاتینگ قابل شناسایی می باشند، به درجات ﳐتلف در فرد بیمار مشاهده می شود و در برخی موارد در سایر بیماری های کبدی مثل انواع هپاتیت های ویروسی HCV - و - HBV، سﲑوز صفراوي اولیه - - PBC و تصلب اولیه بافت صفراوي - PSC - نیز شناسائی می گردند. به ﳘﲔ دلیل یافﱳ آنتی ژن های جدید هدف در این بیماری را از طریق تکنیک الکﱰوفورز دوبعدی برای شناسایی سریع و افﱰاق دقیق این نوع بیماری از سایر بیماریهای مشابه از اﳘیت زیادی برخوردار است.
مواد و روشها:
سرم: 15 بیمار مبتلا به هپاتیت اتواﳝیون که بیماری آهنا از نظر بالینی بصورت قطعی تشخیص داده شده بود، انتخاب شد. از هرکدام خون گرفته شد و سرم آن بدست آمد. بعنوان کنﱰل منفی از داوطلبان ساﱂ خونگﲑی شد و سرم آهنا بدست آمد. سرم های حاصل بعد از تقسیم در -80 ذخﲑه شد و تا زمان استفاده دفریزر نگردید.
استخراج پروتئﲔ و الکﱰوفورز دوبعدی: در این ﲢقیق
رده سلولی HepG2 که از سلوﳍای بافت کبدی بدست آمده است، بعنوان منبع آنتی ژنی استفاده شد. سلوﳍای بدست آمده، بعد از چند بار شستشو بوسیله یک ﳏلول حاوی اوره 7M، تیواوره 2M، CHAPS 4%، Tris 40 mM، % 0.2 آمفولیت 3-10 و 50 mM دي تیوترتیول لیز گردید و پروتئﲔ آن بدست آمد. مقادیر 50, 100, 300 μg پروتئﲔ برروی اسﱰیپ های 7 cm، 3-10 NL بصورت پاسیو بارگﲑی گردید. ایزوالکﱰیک فوآوسینگ با استفاده از دستگاه IEF cell BioRad تا 14000 ولت - ساعت صورت پذیرفت و سپس نوارها بعد از متعادل شدن برروی ژل
SDS-PAGE 12% برده شدند.
اﳝنوبلاتینگ: برای هر ﳕونه بیمار و کنﱰل دو عدد ژل گذاشته شد و بعد از انتقال پروتئﲔ های موجود بر روی غشا PVDF توسط وسﱰن بلات نیمه خشک هر غشا با ﳏلول حاوی skim milk 5% در بافر TBST تیمار شد . بعد از پوشاندن جایگاههای غﲑ اختصاصی از رقت 1/100 سرم ﳕونه های بیمار و کنﱰل بعنوان آنتی بادی اولیه استفاده شد و بعد از چند بار شستشو آنتی بادی anti Human IgGآونژوگه شده با آلکالﲔ فسفاتاز با رقت 1/10000 اضافه گردید. ظاهرسازي نقاط مورد نظر بوسیله BCIP/NBT صورت پذیرفت.
نتایج و ﲝث:
ما در این ﲢقیق وجود اتوآنتی بادی را در 15 ﳕونه مریض و 10 ﳕونه ساﱂ با استفاده از آزمون وسﱰن بلاتینگ جستجو کردﱘ . ابتدا برای تائید افیشنسی ترانسفر از رنگ آمیزی کلوئیدال سیلور استفاده شد.
شکل یک: استفاده از رنگ آمیزی کلوئیدال سیلور برای تائید افیشنسی ترانسفر - A ژل دو بعدی حاوی 100μg از پروتئوم HepG2 بعد از رنگ آمﲑی با بلو سیلور - B غشاء PVDF بعد از انتقال 100μg از پروتئوم HepG2 رنگ آمﲑی شده با کلوئیدال سیلورسپس برای هر ﳕونه دو عدد ﳑﱪان حاوی پروتئوم HepG2 بعنوان منبع آنتی ژنی ﲥیه شد و با استفاده از سرم بیمار یا کنﱰل تیمار گردید. در اینحالت در ﳕونه های ﳐتلف بﲔ 20-100 اسپات بر روی ﳑﱪان بعد از رنگ آمیزی با BCIP/NBT دتکت گردید که نشان دهنده اتوآنتی بادی هایی است که در سرم فرد بر علیه آنتی ژهنای hepG2 تولید شده است - شکل دو - . آنالیز آماری ﳕونه ها با استفاده از نرم افزار - D با استفادهMelanei4 چهار اسپات را نشان داد که با فراوانی بالا در افراد بیمار مشاهده می شد . ﳏل آنتی ژهنای شناسایی شده بر روی یک ژل رفرانس رنگ آمیزی شده با آوماسی آلوئیدال بدست آمد، اسپات های مورد نظر بریده شد و توسط MALDI tof/tof مورد شناسائی قرار گرفت. اطلاعات حاصل از PMF و MS/MS توسط نرم افزار Mascot در بانک اطلاعاتی MSDB جستجو و پروتئﲔ های مورد نظر تعیﲔ هویت شدند.
شکل دو: الگوی اﳝنوبلات دو بعدی بدست آمده بر روی پروتئوم - A, B, C HepG2 با استفاده از سرم بیماران مبتلا به بیماری هپاتیت انواﳝیون به عنوان آنتی بادی اولیه از سرم یک داوطلب ساﱂ به عنوان آنتی بادی اولیه از میان چهار پروتئﲔ تعیﲔ خصوصیت شده دوتا از آهنا ایزوفورم های ﳐتلفی از پروتئﲔ آلبومﲔ بودند که درنواحی 52, 38 kDa مشاهده شدند. بعلاوه حضور آنتی بادی بر علیه یک پروتئﲔ اختصاصی تنظیم کننده گلوکز که بنام BiP خوانده می شود و بعلاوه آنتی بادی دیگری بر علیه پروتئﲔ شوک حرارتی - Hsp 60 - 60kDa در سرم های بیمار مشاهده شد که قابلیت آهنا در شناسایی اختصاصی این بیماری و تفریق آن از سایر انواع بیماری کبدی نیازمند ﲢقیق بیشﱰ است.
