بخشی از مقاله
چکیده
آفتابگردان زراعی یکی از محصولات مهم زراعی میباشد که بدلیل داشتن روغن خوراکی کشت میشود. بیماري پوسیدگی سفید ناشی از Sclerotinia sclerotiorum، یکی ازپاتوژنهاي بسیار آسیب رسانندةآفتابگردان میباشد. تغییردر سیستم آنتی اکسیدانی یقه ساقه و برگهاي ژنوتیپ حساس و مقاوم در زمانهاي 3، 6 ، 12، 24 و 48 ساعت پس از آلودگی مورد بررسی قرار گرفت. تغییر در میزان مالونديآلدهید، محصول نهائی پراکسیداسیون لیپیدها، اندازهگیري شد. چندین شاخص آنزیمی و غیر آنزیمی مثل میزان پرولین و فعالیت آنزیمهاي سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، آسکورباتپراکسیداز و گایاکولپراکسیداز و مقدار پروتئینهاي محلول ارزیابی شد.
نتایج نشان داد که ژنوتیپها سیستم آنتی اکسیدانی مختلفی را در پاسخ به تنش زیستی ناشی از حمله پاتوژن به کار میگیرند. اگرچه پاسخ HR در مقابله با پاتوژن ها کارآمد میباشد، ولی نتوانست به طور کامل گیاهان آفتابگردان را در مقابل آلودگی با قارچ S. sclerotiorum محافظت کند. آنالیز داده ها نشان داد که تفاوت معنیداري بین ژنوتیپها در مقابله با پاتوژن وجود دارد.
محتواي پرولین و پروتئین کل در ژنوتیپ حساس و مقاوم مقایسه با شاهد بدون آلودگی به صورت معنیداري تحت تاثیر قرار گرفت. نتایج حاصل از این مطالعه باعث این نتیجهگیري شد که فعالیت آنزیمها در ژنوتیپ مقاوم افزایش بیشتري یافت یا این افزایش در مقایسه با ژنوتیپ حساس زودتر اتفاق افتاد. ژنوتیپها در چندین پارامتر بیوشیمیایی فعالیتهاي متفاوتی را نشان دادند که می تواند در بررسی برهمکنش پاتوژن – میزبان، انتخاب ژنوتیپهاي مقاوم و تولید ژنوتیپهایی با مقاومت بیشتر در تحقیقات آینده مفید واقع شود.
مقدمه
گیاهان مکانیسمهاي دفاعی بسیار تخصصی را براي مقاومت در مقابل تکثیر پاتوژنها به کار میبرند. پس از تشخیص موفق پاتوژن مهاجم، مسیرهاي مقاومت القا میشوند. این واکنش ها اغلب منجر به بافت مردگی سریع در سلولهاي میزبان در ناحیه آلوده و مقاومت و به دنبال واکنش HR، در بافتهاي سیستمیک مقاومت سیستمیک - SAR - آغاز میشود. یکی از سریعترین پاسخهاي دفاعی به دنبال تشخیص پاتوژن ، انفجار اکسیداتیو میباشد که باعث تشکیل میانجیهاي اکسیژن باز فعال شده - ROS - ، سوپراکسید - O2– - و H2O2 در محل آلودگی میشود. ROS باعث آسیب ماکرومولکولها، جهش در DNA، پراکسیداسیون لیپیدها و تخریب سلولی می شود .
گیاهان از طریق سیستم هاي آنتیاکسیدانی انواع گونههاي اکسیژن فعال را حذف میکنند. سیستم دفاع آنزیمی گیاهان در مقابل این رادیکالهاي اکسیژن آزاد شده شامل superoxide dismutase - SOD - , catalase - CAT - , guaiacol peroxidase - GPX - و ascorbate peroxidase - APX - و دیگر سیستمهاي غیر آنزیمی میباشد
آفتابگردان زراعی یکی از محصولات مهم زراعی میباشد و Sclerotinia sclerotiorum یکی ازپاتوژنهاي بسیار آسیب رسانندة آفتابگردان است
در ایران آلودگی یقه ساقه عامل اصلی کاهش محصول میباشد، بنابراین تولید و توسعه نمونه هاي مقاوم بسیار مهم میباشد. تاکنون منبع مقاومت کامل به قارچ S. sclerotiorum در آفتابگردان گزارش نشده است، ولی گزارشهایی مبنی بر وجود تفاوت در میزان حساسیت ارقام مختلف زراعی آفتابگردان موجود است . - Orellana 1975 - هدف این مطالعه بررسی واکنش سیستم آنتی اکسیدانی ژنوتیپهاي مقاوم و حساس آفتابگردان و همچنین تغییرات کمی پروتئینها در واکنش به بیماري ناشی از S. sclerotiorum میباشد.
مواد و روشها
مواد گیاهی، جدایه قارچی و شرایط آزمایشی
دو ژنوتیپ مقاوم C71 و حساس C146 در مقابل جدایه - Davar et al., 2010 - SSU107 جهت انجام این تحقیق به کار رفتند. بذرها بعد از ضدعفونی شدن در خاك استریل کشت شدند و در اطاق رشد با شرایط کاملا کنترل شده رشد یافتند.
جدایه SSU107 بر اساس قدرت تهاجم آن در آفتابگردان رقم هیبرید cv. Iloflor انتخاب شد . - Davar et al., 2010 - جدایه SSU107 بر روي محیط کشت PDA کشت شد. پس از سه روزدیسکهاي میسلیومی 3 میلیمتري از محیط کشت جدا شدند و در ناحیه یقه ساقه گیاهان قرار گرفتندطرح. کاملاً تصادفی با سه تکرار به کار رفت.نمونه برداري از قسمت پایهاي ساقه ها و برگهاي گیاهان تیمار شده و شاهد در زمان هاي 3، 6 ، 12، 24 و 48 ساعت پس از آلودگی براي تعیین ویژگیهاي بیوشیمیائی، فیزیولوژیکی و آنالیز پروتئینی صورت گرفت.
آنالیز هاي بیوشیمیایی
سنجش میزان پرولین با استفاده از روش Bates و همکاران - 1973 - و اندازهگیري پراکسیداسیون لیپیدها از روش Heath و - 1968 - Paker انجام شد. تهیه عصاره استخراج جهت سنجش فعالیت آنزیمها مطابق روش Lowery و همکاران - 1951 - صورت گرفت. بررسی محتواي آنزیم SOD با روش Beauchamp و - 1971 - Fridovich، آنزیم آسکوربات پراکسیداز بر اساس روش Asada و - 1981 - Nakano، آنزیم کاتالاز مطابق روش Cakmac و - 1991 - Horst و سنجش میزان آنزیم گایاکول پراکسیداز مطابق روش Hemeda و - 1990 - Klein صورت گرفت. سنجش پروتئینهاي محلول مطایق روش برادفورد - 1976 - صورت گرفت و سرم آلبومین گاوي به عنوان رفرنس این ارزیابی استفاده شد.
آنالیز آماري دادهها
از تست t-student براي تعیین اختلافات معنیدار بین میانگین تیمارها استفاده شد. براي رسم نمودارها از برنامه رایانهاي Excel استفاده گردید. در کلیه نمودارها بارهاي عمودي نشان دهنده - SE - n=3 میباشد.
نتایج و بحث
نتایج نشان داد که تفاوتهایی در واکنش سیستم دفاعی ژنوتیپهاي حساس و مقاوم به بیماري وجود دارد - شکلهاي 1، 2 و . - 3 آنالیز دادهها نشان داد که ژنوتیپهاي حساس و مقاوم تفاوت معنیداري در میزان تولید پرولین دارند، تولید پرولین در یقه ساقه ژنوتیپ مقاوم افزایش و در ژنوتیپ حساس کاهش یافت و ساقه هاي ژنوتیپ مقاوم بیشترین افزایش در میزان پرولین را نشان دادند
مقایسه میانگینها نشان داد که برگهاي ژنوتیپ مقاوم نسبت به کنترل بدون آلودگی افزایش معنیداري در میزان پرولین داشت و در 48 ساعت بیشترین مقدار پرولین تولید شد. برگهاي ژنوتیپ حساسC146 کاهش معنیداري را در تولید پرولین نسبت به نمونه آلوده نشده تا 24 ساعت نشان دادند - شکل . - 1B اسید آمینه پرولین در جاروب کردن میانجیهاي اکسیژن فعال شده و رادیکالهاي هیدروکسیل نقش دارد و همسو با نتایج ما افزایش در میزان پرولین، در دیگر آلودگیهاي قارچی نیز گزارش شده است
اثرات سمی اکسالیک اسید، عامل بیماريزاي قارچی، باعث افزایش میزان مالوندي آلدهید - MDA - میشود. این واکنش ها منجر به واکنش HR و پراکسیداسیون لیپیدها میشود
در این بررسی میزان پراکسیداسیون لیپیدها بر اساس میزان تولید MDA اندازهگیري شد و نتایج نشان داد که محتواي MDA در برگ ها و یقه ساقه گیاهان مقاوم وحساس آلوده به S. sclerotiorum افزایش یافته است
شکل :1 تغییرات محتواي پرولین A - و - B و میزان پراکسیداسیون لیپیدها C - و - D در ساقه و برگهاي ژنوتیپهاي مقاوم C71 و حساس C146 در زمانهاي مختلف پس از آلودگی با .Sclerotinia sclerotiorum
نتایج حاصل از بررسی میزان فعالیت نسبی آنزیم SOD در یقه ساقه و برگ ژنوتیپهاي حساس و مقاوم آفتابگردان در شکل 2A و E نشان داده است که طبق این نتایج مقدار آنزیم در ساقه و برگ هر دو ژنوتیپ حساس ومقاوم افزایش معنیداري داشت. این افزایش براي ساقههاي آلوده ژنوتیپ مقاوم زودتر از ژنوتیپ حساس آغاز شد. SOD یک آنزیم کلیدي در حفاظت سلولها در مقابل تنش اکسیداتیو محسوب میشود و عنوان خط اولیه دفاع در تبدیل را دیکالهاي سوپراکسید عمل میکند. در تحقیقات قبلی گزارش شده است که آلودگی آفتابگردان با S. sclerotiorum باعث افزایش مقدار آنزیم SOD میشود
فعالیت آنزیم کاتالاز در واکنش به بیماري اسکلروتینیا در ژنوتیپ مقاوم افزایش و در ژنوتیپ حساس کاهش یافته است - شکل 2B و . - F کاتالاز یک نماینده عمومی اکسیدوردوکتاز است که H2O2 را به آب و مولکولهاي اکسیژن تجزیه میکند. بنابراین H2O2 تولیدي توسط SOD در مرحله بعدي توسط آنزیم CAT پاکسازي میشود .Naglaa and Heba, - - 2011 کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز در ژنوتیپ حساس احتمالا به خاطر افزایش فعالیت دیگر آنزیم هاي جاروب کننده H2O2 مثل APXو GPX میباشد
APX بخشی از مسیر آسکوربات-گلوتاتیون است و نقش مهمی در پاکسازي H2O2 بازي میکند و H2O2 یک سیگنال سیستمیک براي القاء APX میباشد . - Cakmak, 2000 - نتایج ما نشان داد که مقدار این آنزیم در برگهاي گیاهان حساس و مقاوم آلوده به اسکلروتینیا افزایش یافته است، ولی این افزایش مقدار در ژنوتیپ مقاوم بیشتر میباشد و در ژنوتیپ حساس مقدار آنزیمهاي آنتی اکسیداتیو دیرتر از گیاهان مقاوم آغاز میشود - شکل . - 2G ساقه ژنوتیپ مقاوم افزایش و ژنوتیپ حساس کاهش در فعالیتAPX را نشان داد
GPX نیز در واکنشهاي دفاعی به پاتوژنها ودر حذف H2O2 نقش دارند. حضور پاتوژن در سلولهاي پارانشیمی بافت میزبان باعث فعال کردن چرخه آسکوربات-گلوتاتیون و تجزیه مولکولهاي H2O2 میشود . - Garcia-Limones et al. 2002 - در آزمایشهاي ما نیز S. sclerotiorum باعث افزایش مقدار آنزیم GPX در برگها و ساقههاي گیاهان مقاوم و حساس شده است - شکل 2D و . - E درگزارشهاي قبلی افزایش در مقدار آنزیمهاي APX و GPX در برهمکنش S. sclerotiorum با سویا و آفتابگردان - Malencic et al. 2010; Prats et al. 2003 - , گزارش شده است.
