بخشی از مقاله
چکیده
آپتامرها، اولیگونوکلئوتیدهایی صناعی، با اختصاصیت بالا هستند که برای تشخیص آلاینده های مختلف غذایی از پتانسیل بالایی برخوردارند . در این مطالعه، برای کنترل موارد بیش از حد مجاز در استفاده از آنتیبیوتیکها، آپتامرهای اختصاصی برای آنتیبیوتیک فلورفنیکل توسط یک روش SELEX اصلاح شده با بیدهای مغناطیسی جداسازی شدند . در این فرآیند، مجموعه تصادفی اولیهای از DNA تک رشتهای با هدف انکوبه شده و توالیهای متصل شده به آنها برای دورهای بعدی بازیابی میشدند.
شرایط انتخاب بعد از هر دور سختتر میشد و به منظور انتخاب در هر دور محصولات PCR در ژل آگاروز تزریق و کیفیت و کمیت آنها آزمایش میگردید. انتخاب آپتامرها برای 12 دور انجام شد. محصول دور SELEX 11 کلون و 36 آپتامر شناسایی و براساس شباهت بین توالی ها به 5 گروه تقسیمبندی شدند. ثابت اتصال - Kd - سه توالی از گروههای مختلف، با روش فلوریمتری تعیین شد. در نهایت سه توالی80 نوکلئوتیدی شناسایی شدند که از میل پیوندی و اختصاصیت بالایی 211/4 nM - و 96/51 و - Kd= 52/78 برخوردار بودند.
روش فلورسنت برای اندازهگیری باقی مانده فلورفنیکل و متابولیت اصلی آن فلورفنیکلآمین در نمونه های شیر نیز بکار گرفته شد. بازه تشخیص زیست حسگر در بافر PBS در محدوده 5-5000nM و حد تشخیص 1/58 nM و 2/09 nM به ترتیب برای فلورفنیکل و فلورفنیکلآمین به دست آمد. همچنین بازه تشخیص در شیر در محدوده 5-1200nM و حد تشخیص برابر 5/75 nM محاسبه شد. در نهایت برهمکنش بین مولکول فلورفنیکل و آپتامر با روش استاتیک مدلسازی شد. این روش فلورسنت بر پایه صفحات اکسیدگرافن، روشی ساده و سریع برای آنالیز فلورفنیکل و متابولیت اصلی آن فلورفنیکلآمین در شیر خام میتواند باشد.
.1 مقدمه
فلورفنیکل آنتیبیوتیکی صناعی و وسیع الطیف از دسته آمفنیکلها است که بر علیه طیف وسیعی از باکتریهای گرم منفی و برخی باکتریهای گرم مثبت به کار میرود. به علت ممنوعیت مصرف ترکیبات هم خانواده آن کلرامفنیکل و تیامفنیکل، در حیواناتی که به مصرف غذای انسان می رسند، کاربرد فلورفنیکل در دامپزشکی توسعه یافته است. فلورفنیکل طیف اثری مشابه با کلرامفنیکل و تیامفنیکل دارد و به خاطر دارا بودن گروه فلوئور بر طیفی از باکتریهایی که نسبت به کلرامفنیکل و تیامفنیکل مقاوم شدهاند، نیز موثر است.
اگرچه که فلورفنیکل داروی ایمنتری نسبت به دو هم خانواده دیگر خود است ولی نباید از بحث انواع مختلف واکنشهای آلرژیک و بروز مقاومت میکروبی در نتیجه حضور باقیمانده آن در مواد غذایی، غافل ماند - ,1 . - 2 نانو ذرات اکسید گرافن متشکل از ساختار تکلایهای از جنس ورقههای گرافیت هستند که به دلیل اتصال گروههای عامل اکسیژندار، غنی از اکسیژن میباشند - . - 3 به دلیل خصوصیات استثنایی اکسید گرافن شامل مساحت سطحی بزرگ، پراکندگی خیلی خوب در آب، اصلاح سازی سطحی آسان، سازگاری زیستی خوب، همچنین جذب ssDNA روی ورقه های گرافن، توانایی گرافن برای خاموش کردن 1 دهندگان الکترون و توانایی گرافن برای محافظت از بیومولکولها از برشهای آنزیمی پتانسیل کاربرد گرافن و اکسید گرافن 2 - GO - را در مطالعات بیولوژیکی به اثبات رساند - . - 4
آپتامر یک اولیگونوکلئوتید DNA یا RNA است که به صورت برونتن برای اتصال به یک مولکول هدف انتخاب شده است - . - 5 آپتامرها تمایل بالایی برای اهداف خود دارند و ویژگیهایی دارند که بر آنتی بادیها برتری دارد از جمله اندازه آنها کوچک است، ایمونوژن نیستند و امکان تغییرات شیمیایی روی آنها برای بهینهکردن خصوصیات وجود دارد. به همین دلیل استفاده ازآپتامرها برای اهداف تشخیصی و درمانی، حرکتی رو به جهش دارد - . - 6
امروزه بیوسنسورها یا حسگرهای زیستی برای کنترل موادغذایی ایدهآل هستند چرا که تمام ویژگیهای یک روش غربالگری خوب را دارا می باشند یعنی حساس، ساده، سریع و مقرون به صرفهاند و نیازمند مراحل پیچیده تهیه نمونه نیستند. زیست حسگرها متشکل از یک جزء تشخیصی بیولوژیک با قابلیت درک اختصاصی مولکول هدف، همراه با یک ابزار مناسب القاءکننده سیگنال میباشند که از طریق آن اتصال یا واکنش بین هدف و جزء تشخیصی به یک سیگنال معنادار تبدیل میگردد.
در تولید حسگرهای زیستی میتوان از آپتامرها بهخاطر خصوصیات فوقالعاده شان استفاده کرد . - 7 - در این مطالعه از زیست حسگری نوری از نوع فلورسنت بر پایه اکسیدگرافن استفاده شده است. فلورسنت شامل انتقال انرژی از یک فلوئوفور دهنده به یک فلوئوفور گیرنده است. سطح وسیع حلقوی گرافن آن را برای جذب بیومولکولها بالاخص ssDNA مناسب میکند که میتواند بسیار محکم به سطح گرافن متصل شود. در این برهم کنش مولکولهای تک لایه ssDNA به هر دو سطح ورقههای گرافن به وسیله پیوندهای - جذب می شوند.
گرافن و اکسید گرافن میتوانند به عنوان یک خاموشکننده بسیار موثر عمل کنند. پیوند - بین ساختمان حلقوی بازهای ssDNA و خانههای شش ضلعی گرافن ایجاد شده در حالیکه dsDNA نمیتواند بطور پایدار به علت سپری که در اثر بارمنفی گروه فسفات ایجاد میشود با گرافن پیوند برقرار کند - . - 4 ویژگی های منحصر به فرد و توانایی آپتامرها در ایجاد ساختار سه بعدی و نیز میل پیوندی، حساسیت و اختصاصیت بالای آنها - 9 ,8 - سبب شد که به دنبال آپتامر اختصاصی برای فلورفنیکل و روش مناسب برای آنالیز باقیمانده فلورفنیکل در شیر خام از لحاظ وجود مقادیر غیر قانونی - بیشتر از - MRL فلورفنیکل باشیم.
.2 مواد و روش کار
1 . 2 مواد اولیه
فلورفنیکل آمین - - FFA، فلورفنیکل - - FF، کلرامفنیکل، انروفلوکساسین، آموکسی سیلین، تتراسایکلین و GO از شرکت Sigma-Aldrich - آمریکا - خریداری شد. بیدهای مغناطیسی فعال شده با گروه توسیل نیز از شرکت Invitrogen - آمریکا - تهیه شد. مخزن آپتامری اولیه - کتابخانه - حاوی حدود 10 15مولکول DNA با توالی رندوم مرکزی 43 نوکلئوتید که در دو طرف آن دو توالی 18 و 19 نوکلئوتیدی برای هیبرید شدن پرایمرها جهت PCR وجود دارد - - 5ʼ-GCTGTGTGACTCCTGCAA-43N-GCAGCTGTATCTTGTCTCC-3ʼ و همچنین پرایمر فوروارد و پرایمرمعکوس فسفوریله برای سنتز به شرکت Bioneer سفارش داده شدند. الیگونوکلئوتیدهای فلورسنتدار با ATTO647N بوسیله شرکت Microsynth تهیه شدند. مواد موردنیاز PCR از شرکت سینا کلون تامین شد. بقیه مواد شیمیایی موردنیاز نیز از مرک - آلمان - خریداری شد.
2 . 2 اتصال فلورفنیکل به بیدهای مغناطیسی
به منظوراتصال فلورفنیکل به بیدهای مغناطیسی مقادیر موردنیاز از بیدهای مغناطیسی فعال شده با گروه توسیل با ورتکس به خوبی سوسپانسیون شد و برای اتصال به فلورفنیکل مورد استفاده قرار گرفت. اتصال فلورفنیکل با بیدهای مغناطیسی، با انکوباسیون بیدها به مدت یک شب 18 - ساعت - در دمای37 درجه سلسیوس توأم با همزدن ملایم رخ میدهد. تاییداتصال فلورفنیکل به بید با تکنیک 3IRانجام شد.
3 .2 جداسازی آپتامرهای اختصاصی برای فلورفنیکل با استفاده از چرخه 4SELEX
در هر چرخه SELEX ابتدا مخزن آپتامری حاوی توالیهای تصادفی 10 DNA دقیقه در دمای 90 درجه حرارت داده شد، به سرعت تا دمای 4 درجه خنک شده و به مدت 15 دقیقه در این دما باقی ماند و سپس به مدت 7 دقیقه در دمای 25 درجه انکوبه گردید. این مرحله به آپتامرها این امکان را میدهد تا ساختار سه بعدی خود را پیدا کنند. سپس با بیدهای پوشیده شده با فلورفنیکل مجاور می شوند. این مخلوط به مدت 45 دقیقه توأم با هم-زدن ملایم در دمای اتاق انکوبه شد و سپس الیگونوکلئوتیدهای متصل نشده با 5 مرحله شستشو با بافر اتصال حذف گشتند.
برای بدست آوردن آپتامرهایی با میل پیوندی بالاتر و اختصاصیتر همزمان با افزایش دورهای SELEX تعداد دفعات شستشو افزایش داده شد. همچنین زمان انکوباسیون از 45 دقیقه به 30 دقیقه به تدریج کاهش یافت. برای شستشوی الیگونوکلئوتیدهای متصل شده و جدا نمودن از بیدهای مغناطیسی پوشیده شده با فلورفنیکل، کمپلکس DNA با بیدها، با بافرElution در دمای 80 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه توأم با همزدن ملایم مخلوط و سپس بیدها و ssDNA با جداسازی مغناطیسی از هم جدا شدند. الیگونوکلئوتیدها بدست آمده با PCR تکثیر و به منظور تک رشتهای کردن الیگونوکلئوتیدها، از پرایمر معکوس فسفوریله شده در انتهای 5' و آنزیم لامبدا اگزونوکلئاز5 استفاده شد.
4 .2 انتخاب بهترین راند
پس از اتمام مراحل SELEX، الیگونوکلئوتیدهای تک رشتهای بدست آمده از راندهای مختلف با پرایمر فوروارد فلورسنت با رنگ ATTO647N در انتهای 5' تکثیر شدند. راند SELEX با بهترین افینیتی به روش فلوریمتری انتخاب شد.
5 .2 کلون کردن
پس از انتخاب بهترین راند، آپتامرهای این راند در باکتری E. Coli K5 مطابق با دستورالعمل کیت وارد پلاسمید آن شدند. سپس تخلیص پلاسمیدها بوسیله کیت انجام شد.
