بخشی از مقاله
چکیده: لاکتیک اسید باکتری ها، میکروارگانیسم های اصلی میکروفلور طبیعی شیر خام هستند. سویههای زیادی از آنها که در سیستمهای غذایی حضور دارند باکتریوسین تولید کرده و علیه گونه های مشابه فعالیت می کنند. تولید باکتریوسین در لاکتیک اسید باکتری های موجود در صنایع لبنی شایع است. باکتریوسین های تولیدشده از لاکتیک اسید باکتری ها مواد ضدمیکروبی پپتیدی هتروژن هستند که در طبیعت عمل، شرایط عمل، جرم مولکولی، منبع ژنتیکی و خواص بیوشیمیایی با هم فرق دارند.
تولید این پپتیدها اولین مرحله دفاع میکروبی و قسمتی از فعالیتهای ایمونولوژیکی باکتری است. فرق باکتریوسین ها با آنتی بیوتیک ها این است که باکتریوسین ها توسط ریبوزوم تولید شده و نوع عملکرد آنها، طیف عملکرد و سمیت و مکانیسم مقاومت آن ها متفاوت است. نایسین به عنوان یک باکتریوسین از رشد اسپورهای باسیلوس و کلستریدیوم جلوگیری میکند. این ماده به عنوان یک نگهدارنده طبیعی در غذاها بوده و قابلیت استفاده در مواد دارویی، دامپزشکی و بهداشتی را دارد. تولید نایسین در فاز رشد میکروارگانیسمها انجام گرفته و به طور کامل در فاز سکون تولید آن متوقف می شود. تعداد لاکتیک اسید باکتری ها به علت طولانی شدن زمان سرمایش و استفاده از مواد بهداشتی کاهش مییابد.
مقدمه:
پپتیدهای زیادی که دارای خواص ضدمیکروبی هستند توسط طیف گستردهای از ارگانیسمهای زنده، از پروکاریوت تا یوکاریوت تولید میشوند. پپتیدهای باکتریایی ضدمیکروب که توسط ریبوزوم ساخته میشوند باکتریوسین نام دارند که که از دو طریق با آنتیبیوتیک ها تفاوت دارند. اول اینکه این مواد جزء مواد اولیه هستند در حالیکه آنتی بیوتیک ها جزء مواد ثانویه می باشندکه، معمولاً فقط بر روی باکتریهای شبیه به گونه مولد مؤثر هستند، یعنی طیف عملکرد باریکی دارد. اگرچه سایر باکتری های گرم منفی و گرم مثبت می توانند تولید باکتریوسین کنند، ولی باکتریوسین تولید شده از لاکتیک اسید باکتری ها به علت توانایی استفاده در صنایع غذایی از اهمیت خاصی برخوردار است. باکتریوسینهای تولید شده از لاکتیک اسید باکتریها به سه گروه زیر تقسیم میشوند:
-1 باکتریوسین های اصلاح شده - لانتیبیوتیکها
-2 پپتیدهای کوچک کنارهم ، مقاوم به گرما، کاتیونی، آمفی فیلیک و هیدروفوب، بدون اسید آمینه های اصلاح شده
-3 مولکول های بزرگتر مقاوم به گرما لاکتیک اسید باکتری ها ، به طور طبیعی در میکروفلور شیر خام حضور دارند. سویه هایی از لاکتیک اسید باکتری ها در سیستم های غذایی حضور دارند که باکتریوسین تولید کرده و علیه گونه های مشابه فعالیت می کنند. پیدا کردن باکتریوسین های لاکتیک اسید باکتریها با فعالیت گسترده علیه میکروارگانیسم های عامل فساد و بیماریزا، موجب تمایل به استفاده از آنها به عنوان نگهدارنده در غذاهایی همچون لبنیات شده است. تولید باکتریوسین در لاکتیک اسید باکتری های موجود در صنایع لبنی شایع است.
نایسین یک باکتریوسین تجاری مورد استفاده جهت جلوگیری از بادکردگی ناشی از گاز در پنیر است. کاربرد آن حتی تا جلوگیری از رشد لیستریا مونوسیتوژنز در پنیر کاممبرت گسترده شده است. لاکتیسین که توسط گونه لاکتوکوکسی تولید می شود به عنوان مانع رشد لیستریا مونوسیتوژنز در پنیر کاتیج و مانع رشد لاکتیک اسید باکتریهای غیر استارتری در پنیر چدار است. همچنین پدیوسین تولیدشده از پدیوکوکسی و لاکتوباسیلوس تعداد لیستریامونوسیتوژنز را در سطح پنیر Munster کاهش میدهد.
باکتریوسین های انتروکوکوسی خواص ضدلیستریایی قوی در شیر و پنیر نشان می دهند. تعداد لاکتیک اسید باکتریها در شیر خام به علت طولانی شدن مدت سرمایش و اسستفاده از موارد بهداشتی کاهش می یابد. از سوی دیگر تعداد سویهای مورد استفاده در صنایع تخمیری لبنی نسبتاً کم است. شیر خام منبع خوبی از گونههای للاکتیک اسدباکتری برای کنترل میکروفلور ناخواسته در صنایع لبنی است.
نایسین نایسین یک ماده ضدمیکروبی پپتیدی طبیعی است که توسط سویه های لاکتوکوکوس لاکتیس تولید شده و تأثیر ضدمیکروبی خوبی روی باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت دارد. همچنین از رشد اسپورهای باسیلوس و کلستریدیوم جلوگیری میکند. این ماده همچنین به عنوان یک نگهدارنده طبیعی در غذاها بوده و قابلیت استفاده در موارد دارویی، دامپزشکی و بهداشتی را داراست. لاکتیک اسید باکتری ها، باکتری های گرم مثبت، میکروائروفیلیک و غیرتولیدکننده اسپور هستند که ماده اصلی برای تخمیر لاکتیک اسید می باشند و به عنوان میکروارگانیسم اصلی در میکروفلور طبیعی شیر خام هستند.
باکتریوسینهای تولید شده از لاکتیک اسید باکتریها، مواد ضدمیکروبی پپتیدی هتروژن هستند که در طیف عمل، شرایط عمل، جرم مولکولی، منبع ژنتیکی و خواص بیوشیمیایی با هم فرق دارند. تولید این پپتیدها اولین مرحله دفاع میکروبی و قسمتی از فعالیت های ایمونولوژیکی باکتری است. فرق باکتریوسینها با آنتیبیوتیکها این است که باکتریوسینها توسط ریبوزوم تولید شده و نوع عملکرد آنها از نظر طیف عملکرد، سمیت و مقایسه مقاومت آنها متفاوت است.
نایسین توسط لاکتوکوکوس لاکتیس زیرگونه لاکتیس تولید می شود. تولید آن در فاز لگاریتمی رشد میکروارگانیسم انجام گرفته و به طور کامل در فاز سکون تولید آن متوقف می شود. از لحاظ ساختار پپتیدی با 34 آمینواسید می باشد و ویژگی های کاتیونی و هیدروفوبی از خود نشان میدهد. جرم مولکولی آن 500 دالتون می باشد. حضور آمینواسیدهای غیرمعمول همچون لانتیوتین مسئول عملکرد و ویژگیهای نایسین به طور مثال مقاومت در برابر اسید و حرارت و خواص ضدمیکروبی است.
تنوع نایسین بسیار کم است . - A,Z - که فرق آنها در نوع اسیدآمینه موجود در سایت 27 است که در A، هیستیدین و در Z، آسپارژین است. اصلاحات ساختاری هیچ تأثیری بر روی خواص ضدمیکروبی نایسین نداشت ولی موجب حلالیت بیشتر نایسینZ می شودکه ویژگ مهمی در کاربردها در غذاهاست. تولید نایسین توسط فاکتورهای کشت همچون سویه تولیدکننده، مواد مغذی محیط،pH، دما، هوادهی و آژیتاسیون و فاکتورهای دیگری همچون ماده بازدارنده، چسبیدن نایسین به سلول تولیدکننده و نابودی از طریق آنزیم بستگی دارد.
کاهش چشمگیری در مقدار نایسین بعد از رسیدن به حداکثر مقدار مشاهده میشود که یا ناشی از پروتئولیز و یا ناشی از چسبیدن نیسین به دیواره سلول است. چسبیدن نایسین به سلول زنده به pH محیط کشت بستگی دارد که طرح کلی برای چسبیدن باکتریوسینها نسبت به pH به این صورت است که در pH=6 بیشترین چسبندگی وجود دارد و در pH=2 باعث خروج کامل باکتریوسین از سلول میشود.
علاوه بر این محدودیت، مقاومت و فعالیت بیولوژیکی نایسین به pH محلول بستگی دارد. در طی فرآیند تخمیر در pH<6تقریباً 80 درصد نایسین تولیدشده به محیط آزاد میشود و در pH>6 بیشتر نایسین به دیواره سلولی می چسبد. حلالیت و مقاومت نایسین به طور چشمگیری با کاهش pH، کاهش مییابد. علاوه بر این نایسین در pH=2 مقاوم بوده و میتواند در 121 C به مدت پانزده دقیقه بدون غیرفعال شدن اتوکلاو شود. ولی در pHهای خنثی و قلیایی نامحلول است.
تولید نایسین با استفاده از محیطهای طبیعی و سنتتیک نایسین با تخمیر جریان شیر یا آب پنیر توسط سویه لاکتوکوکوس لاکتیس زیرگونه لاکتیس تولید میشود. عصاره تخمیر شده تغلیظ میگردد و جداسازی می شود و سپس توسط خشککن پاششی خشک شده و به ذرات بسیار کوچک آسیاب میشود. محصول نهایی به صورت تجاری قابل فروش است و معمولاً شامل پروتئین های شیر و نمک ها، 2/5 درصد نایسین، 74/4 درصد سدیم کلرید، 23/8 درصد مواد جامد دناتوره شده و 1/7 درصد رطوبت است.
این محصول قیمت بالایی دارد و به همین علت بهتر است که فعالیت تجاری نایسین را بهبود داده و از هزینههای تولید بکاهیم. تولید بهینه نایسین، محیط کشت و شرایط کنترل شده دما و pH را میطلبد. کاهش pH به علت تولید اسیدلاکتیک از فاکتورهای محدودکننده رشد است. لذا برای کشت لاکتوکوکوس لاکتیس، استفاده از محیط کشت تجاری ضروری است، اما قیمت بالای آنها، استفاده در تولید انبوه را محدود می کند. علاوه برآن محیط کشت مناسب برای رشد لاکتیک اسید باکتریها، نیاز به پروتئین مازاد - تریپتون، پپتون، عصاره گوشت و عصاره مخمر - دارد که قسمت عمده آن بدون استفاده باقی مانده و موجب تحمیل هزینه اضافی و دشوار کردن خالص سازی باکتریوسین می شود. لذا تعیین فرمولاسیون ارزان تر برای تولید نایسین بسیار جالب توجه است.
جایگزین های احتمالی برای محیط کشت نایسین می تواند مواد باقی مانده از آبپنیر، ملاس قند و فاضلاب فرآیند گوشت باشد. شیر معمولاً برای پایداری بیشتر طی نگهداری و ایمنی میکروبی، حرارت داده میشود. نایسین بر روی مقاومت حرارتی میکروارگانیسم ها تأثیر میگذارد. بنابراین D value در باکتری باسیلوس سرئوس در شیر با حضور نایسین تا 40 درصد در دمای 100 C کاهش خواهد یافت. با هدف تولید این باکتریوسین ارزشمند، محققان تأثیر ساکارز و آسپارژین را - 7/5 - 75 g/l - ، پتاسیم فسفات - - 6-18g/l و -6g/l - Tween80 - 1 را بر روی محیط کشت MRS broth در تولید نایسین توسط لاکتوکوکوس لاکتیس بررسی کردند.
فرمولاسیونی که باعث افزایش تولید نایسین میشود5g/l ساکارز به همراه 29 g/l آسپارژین است. مطالعات زیادی در این راستا برای تعیین محیط استاندارد broth MRS, M17 انجام شده و ثابت شده است که غنی سازی این محیط کشت ها با - 1-12/5 g/l - ساکارز، - 0/13 g/l - پتاسیم فسفات و - 0/5 g/l - آسپارژین و رقیق کردن به نسبت 1:1 با شیر پس چرخ، باعث بهبود تولید نایسین خواهد شد. خود شیر پس چرخ نیز میتواند به عنوان محیط کشت استفاده شود.
بهترین فعالیت نایسین در محیط کشت با شیر حاوی 25 درصد از شیر که به 25 درصد محیط کشت MRS یا M17 اضافه شد، مشاهده گشت. با توجه با اینکه با افزایش مواد مغذی شیر گاو، هزینه تولید کاهش می یابد، برخی محققان به مطالعه کشت لاکتوکوکوس لاکتیس در شیر پس چرخ با استفاده از هم زدن و غلظت های مختلف پرداختند. نتایج نشان داد که در شیر استاندارد 25 درصد، فعالیت نایسین 3 برابر نسبت به شیر 50 درصد و 85 برابر نسبت به شیر 12/5 درصد بیشتر است و این نشان می دهد که رقیق کردن شیر باعث افزایش فعالیت نایسین خواهد شد. علاوه بر استاندارد کردن شیر، محققان بررسی کردند که کدامیک از مواد مغذی شیر بر تولید نایسین مؤثرتر است و مواد محیط کشت را به صورت مصنوعی دستکاری کردند و مشاهده شد که در این گونه محیطهای مصنوعی، سلول حتی رشد هم نمی کند.
بسیاری از کارخانجات لبنی، روش درستی برای دفع آب پنیر نداشته و روش های بیولوژیکی تجزیه آن نیز گران است. اگرچه روشهای مختلفی برای استفاده از آب پنیر بیان شده، ولی هنوز هم بخش اعظمی از آن به عنوان فاضلاب دور ریخته میشود. دفع آبپنیر به محیط مشکلات جدی را به بار می آورد. زیرا باعث تغییرات فیزیکی و شیمیایی خاک شده و بازده محصولات را کاهش میدهد و از طرفی با کاهش اکسیژن نامحلول موجب از بین رفتن در آب می شود. برای حل ایننن مشکل بهتر است که از مواد مغذی آن نهایت استفاده را ببریم تا محصولات تولیدشده بتواند هزینه تصفیه آن را برآورده کند.
خالصسازی نایسین تولیدکنندگان نایسین، لاکتیک اسید باکتری هایی هستند که برای رشد نیاز ه محیط کشت کمپلکس دارند و این موضوع نه تنها باعث افزایش هزینه تولید میشود، بلکه خالصسازی نایسین را نیز دچار مشکل میکند. به صورت غیرتجاری، نایسین از طریق کروماتوگرافی تبادل یون،RP. HPLC و immunoaffinity خالص سازی می شود. این روش ها باعث افزایش قیمت نایسین خواهند شد. به طور جایگزین می توان نایسین را از طریق رسوب با حلال های آلی همچون اتانول، متانول،آمونیوم سولفات و محلول اسیدی خالصسازی کرد.
محقق دیگری خلوص نایسین را توسط سیلسیلیک اسید به همراه میکروفیلتر به عنوان جایگزین مطرح کرد تا از، از بین رفتن نایسین به علت چسبیدن به سلول تولیدکننده و از بین رفتن آنزیمی توسط پروتئاز جلوگیری شود. نایسین به عنوان نگهدارنده طبیعی در مواد غذایی امروزه مصرف کنندگان، غذاهایی با حداقل فرآیند و با کیفیت بالا را که ایمن و عاری از نگهدارندههای شیمیایی هستند، ترجیح میدهند.
عوامل ضدمیکروبی طبیعی متعددی در حیوانات، گیاهان و میکروارگانیسم ها وجود دارند. با وجود اینکه تا به امروز باکتریوسینهای زیادی از لاکتیک اسید باکتریها شناسایی شدهاند، استفاده از این مواد به عنوان نگهدارنده غذایی هنوز محدود است. باکتریوسینهای دیگر مثلاً پدیوسین ممکن است در کاربردهای غذایی استفاده شوند، ولی به طور متداول اجازه استفاده به عنوان افزودنی ضدمیکروبی در غذا را ندارند.
باکتریوسینی که بیشتر از بقیه مورد مطالعه قرار گرفته است نایسین می باشد، که تنها باکتریوسین مجاز برای کاربردهای غذایی است و کاربرد وسیعی در صنعت غذا یافته است. این باکتریوسین برای اولین بار در سال 1953 در انگلستان وارد بازار شد و پس از آن مجوز استفاده را در بیش از 48 کشور دریافت کرد. جدول زیر تعدادی از کشورهایی را که اجازه استفاده از نایسین را داده اند و حداکثر مقدار مجاز آن را نشان میدهد.
