بخشی از مقاله
چکیده
نانوذرات نقره کاربردهای فراوانی در علوم پزشکی، دارویی و صنایع مختلف دارند. تاکنوم مطالعات بسیار اندکی در ارتباط با تولید نانوذرات توسط آرکیهای نمک دوست انجام شده است. در پژوهش حاضر به منظور ارزیابی توانمندی این گروه از پروکاریوت ها در سنتز نانوذرات نقره، پروکاریوت های نمک دوست افراطی از حوضچه های نمکی پلاژ تیس چابهار جداسازی شدند. حداقل غلظت بازدارندگی برای سویه ها تعیین گردید و سویه های با بیشترین میزان مقاومت شناسایی شدند. سنتز زیستی نانوذرات نقره با دو روش: - 1 تلقیح سویه های آرکی در محیط کشت مایع SW حاوی 0/5 میلی مولار نیترات نقره و نگهداری محیط های کشت در 37 و در شیکر با دور 150 rpm؛ - 2 افزودن محلول نیترات نقره با غلظت 0/5 میلی مولار به کشت میکروبی 7 روزه در دمای اتاق و تاریکی انجام گرفت.
ارزیابی تولید نانو ذرات با تغییر رنگ محلول واکنش بررسی و جذب نوری محلول حاوی نانوذرات سنتز شده توسط اسپکتروفوتومتری UV-vis تعیین گردید. از مجموع 50 سویه آرکی نمک دوست بدست آمده 32 سویه تا غلظت 1 میلی مولار، 9سویه تا غلظت 0/05 میلی مولار و 9 سویه تنها در محیط فاقد نیترات نقره قادر به رشد بودند. از میان سویه های با بیشترین مقاومت، سویه E106 متعلق به جنس Haloferax قادر به سنتز بیشترین میزان نانو ذرات نقره در هر دو روش بکار رفته بود. بر اساس نتایج حاصل، سویه های آرکی نمک دوست جداسازی شده از حوضچه های برداشت نمک گزینه های مناسبی جهت سنتز زیستی نانوذرات نقره می باشند.
واژگان کلیدی: نانوذرات نقره، آرکیهای نمکدوست، جنس Haloferax
-1 مقدمه
فناوری نانو چشم انداز وسیعی برای توسعه محصولات جدید با کاربردهای صنعتی و مصرفی در طیف گسترده ای از بخش ها ارائه می کند . - Singh, 2015 - این فناوری بر ذراتی با اندازه 1 تا 100 نانومتر تأکید دارد - Narayanan, 2010 - که به دلیل اندازه کوچک و نسبت سطح به حجم زیاد، دارای ویژگی های منحصر به فرد الکتریکی، فیزیکی، شیمیایی، اپتیکی و زیستی نسبت به ترکیبات حجیم مشابه خود هستند . - Singh, 2015; Iravani, 2014 - در این میان، نانوذرات نقره به دلیل رسانایی خوب، پایداری شیمیایی، خواص کاتالیتیک، فوتونیک و اپتوالکترونیک، و نسبت سطح به حجم بالا بسیار مورد توجه بوده اند و جزء معروف ترین نانوذرات فلزی به شمار می روند - . - Singh, et al., 2015; Hussain & Pal, 2008 نقره از دیرباز به عنوان یک ماده ضدعفونی کننده قوی مورد توجه بوده است، اما به دلیل توسعه آنتی بیوتیک ها، مواد شیمیایی ضد باکتری و گسترش مقاومت آنتی بیوتیکی استفاده از آن محدود شده بود.
با این حال، با توسعه مقاومت به ترکیبات ضد میکروبی در میکروارگانیزم ها، استفاده مجدد از نقره به عنوان یک ماده ضدمیکروبی قدرتمند رونق یافته است - . - Singh, et al., 2015 استفاده نانوذرات نقره در پوشش ضدمیکروبی تجهیزات پزشکی، تهیه پانسمان زخم ها، سنسور های زیستی، مواد پرکننده دندانی، پوشش الیاف در صنعت نساجی، سیستم های تصفیه کننده آب و فاضلاب، دترجنت ها، لوازم آرایشی و بهداشتی - - Prabhu & poulose, 2012; Marambio-Jones & Hoek, 2010، به عنوان ترکیبات حشره کش و ضد سرطانی قوی از موارد متعدد کاربرد آن ها محسوب می گردد . - Singh, et al ., 2015 -
نانوذرات با دو روش فیزیکی و شیمیایی قابل سنتز هستند که کاربرد آن ها به دلیل مشکلاتی از جمله تحمیل هزینه های تولید بالا، استفاده از حلال های آلی شیمیایی و سمی خطرناک، ایجاد آلودگی های زیست محیطی و چالش برانگیز بودن حفظ پایداری در نانوذرات تولید شده بسیار محدود شده است . - Mandal, 2006; Prabhu & poulose, 2012 - بنابراین، اخیرا تولید نانوذرات با روش های زیستی به علت هزینه تولید کمتر، سازگاری بیشتر با محیط زیست، ایجاد نانوذرات پایدارتر با امکان کنترل نرخ تولید و اندازه نانوذرات بسیار توسعه یافتهاند . - Moreno, et al., 2013; Mandal, 2006 - در این روش ها از گیاهان و میکروارگانیسمهایی مثل قارچها، مخمرها، اکتینومیستها و باکتریها جهت تولید نانوذرات استفاده می شود - Sharma, et al., 2010; Ramesh, et al., .2015 - باکتریها به دلیل سرعت تکثیر زیاد و امکان بیشتر دستورزیهای ژنتیکی بیشتر از سایر میکروارگانیسمها مورد توجه واقع شده اند Sharma, et al., . - 2010 -
هنگامی که میکروارگانیسمها در معرض یونهای سمی فلزی قرار می گیرند، این مواد را به صورت خارج سلولی و یا داخل سلولی از طریق مکانیسم های دفاعی متفاوت به نانوذرات فلزی احیاء میکنند . - Ramesh, et al., 2015; Prabhu & poulose, 2012 - پروکاریوتهای نمک دوست افراطی سویه های غالب در آبهای پرشور و حوضچه های نمکی با غلظت های نمک 9 تا 10 برابر بیشتر از آب دریا %35-30 - در مقابل - NaCl%3,5 بوده و اکثرا جزء قلمرو آرکیها می باشند. این میکروارگانیسم ها عمدتا بخاطر وجود پیگمان کارتنوئید به رنگهای قرمز یا صورتی دیده می شوند و به علت شرایط پرتنش محیطی از جمله دمای بالاتر از 40 درجه سانتی گراد، pH بسیار قلیایی و غلظت نمک %15-%35، در عرصه زیست فناوری بسیار مورد توجه واقع شده اند - Nercessian, et al., 2015; . Patel , et al., 2010 -
از طرف دیگر، محیط های دریایی، مصب رودخانه ها و حوضچه های نمکی مصنوعی، به علت تماس با آب رودخانه ها و دریاها، فوران های آتشفشانی، هوازدگی سنگها و فعالیت های انسانی، اکوسیستم های طبیعی برای ذخیره فلزات سنگین بوده و محل مناسبی برای حضور و فعالیت میکروارگانیسم های تحمل کننده فلزات سنگین هستند. از این رو آرکی ها و باکتری های نمک دوست به طور پیوسته در معرض فلزات بوده و جهت مقابله و سازگاری با این شرایط پرتنش محیط زیست طبیعی خود، سیستم های مقاومت به فلزات سنگین را درخود گسترش داده اند - Kowshik, 2013 - بنابراین ارگانیسم های نمک دوست کاندیدهای مناسبی جهت سنتز نانوذرات به شمار می روند - . - Srivastava & Kowshik, 2015
آرکی های نمک دوست دارای استراتژیهای مقاومت فلزی مثل آنزیم های احیاء کننده و سمزدا خصوصا نیترات ردوکتاز و چلاترهای فلزی، پمپ های افلاکس پیشرفته، ژنها و اپرانهای مقاومت فلزی و فرآیندهای کاهش شارش یون ها به داخل سلول هستند که سبب توانایی مقابله آن ها با فلزات سنگین و به دنبال آن سنتز نانوذرات می گردد - Kowshik, 2013; Srivastava, et al., .2013 - لازم به ذکر است که تاکنون مطالعات اندکی در خصوص پتانسیل سنتز نانوذرات مختلف توسط آرکی های نمک دوست صورت گرفته است و هنوز در مراحل ابتدایی تحقیقات می باشد - . - Srivastava, et al., 2013 از این رو، هدف از پژوهش حاضر شناسایی آرکی های نمک دوست افراطی جداسازی شده از حوضچه های برداشت نمک پلاژ تیس چابهار با توانمندی سنتز نانوذرات نقره میباشد تا بدین ترتیب روشی سودمند و نوین جهت سنتز زیستی این نانوذرات ارائه گردد.
-2 مواد و روشها -1-2 نمونه برداری و جداسازی پروکاریوت های نمک دوست افراطی
نمونه برداری از حوضچههای نمکی چابهار واقع در استان سیستان و بلوچستان در ظروف در دار استریل انجام گردید. نمونههای تهیه شده شامل آب نمک، نمک و خاک کنار حوضچه بوده که تا زمان انجام آزمایشات در تاریکی و دمای محیط نگهداری شدند. جهت جداسازی سویههای نمک دوست افراطی ابتدا مقدار 1 گرم از نمونه های خاک و نمک و 1 میلی لیتر از نمونه آب نمک داخل 9 میلی لیتر آب نمک % 20 استریل اضافه گردید و رقت اولیه 10-1 بدست آمد. سپس با افزودن 1 میلی لیتر از رقت اولیه به 9 میلی لیتر آب نمک %20 استریل رقت 10-2 تهیه شد و به این ترتیب رقت سازی تا رقت 10-4 انجام گردید. مقدار مناسب از هریک از رقت های تهیه شده در محیط کشت جامد - Salt Water - SW شامل - گرم در لیتر - : - 156 - NaCl، - 27/7 - MgCl2. 6H2O، - 39/6 - MgSO4.7H2O، - 0/76 - CaCl2، - 4 - KCl، - 0/2 - NaHCO3، - 0/5 - NaBr، - 2 - Yeast Extract، - 10 - Peptone، - 15 - Agar و pH معادل 7/2 کشت شد و پلیت ها در دماهای 30 و 37 درجه سانتی گراد به مدت 10 روز انکوبه شدند. در ادامه با انجام کشت چهار مرحله ای سویههای خالص بدست آمدند و بر اساس مشاهدات مورفولوژیکی کلنی و تصویر میکروسکوپی انتخاب شدند.
-2-2 تعیین حداقل غلظت بازدارندگی رشد1
جهت شناسایی جدایه های نمک دوست افراطی مقاوم به نقره و تعیین حداقل غلظت بازدارندگی رشد ابتدا محلول ذخیره 0/1 مولار با استفاده از نمک نیترات نقره - مرک - در آب دیونیزه تهیه و با عبور از فیلتر 0/22 ʽm استریل گردید. غلظت های متفاوت نقره شامل 0/05، 0/1، 0/25، 0/5 و 1 میلی مولار با افزودن مقادیر مناسب از محلول ذخیره به محیط کشت جامد SW در کنار محیط کنترل تهیه شدند. از سویه های انتخاب شده غلظت معادل 0/5 استاندارد مک فارلند تهیه به صورت نقطه ای در محیط های کشت جامد حاوی غلظت های متفاوت نیترات نقره کشت شدند و به مدت 10 روز در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد انکوبه گردیدند.
-3-2 بررسی سنتز نانوذرات نقره و شناسایی مولکولی سویه های تولیدکننده
بدین منظور از سویه های مقاوم در غلظت 0/1 میلی مولار نقره، به میزان %5 با 0/6 OD معادل 4 استاندارد مک فارلند در محیط کشت مایع SW حاوی غلظت های 0/1 و 0/5 میلی مولار تلقیح شد و انکوباسیون در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتی گراد با سرعت 150 دور دردقیقه صورت گرفت. تغییر رنگ سوسپانسوین های میکروبی پس از گذشت 10 روز نسبت به نمونه شاهد - محیط کشتSW به همراه محلول ذخیره نیترات نقره - به صورت چشمی بررسی شد.در روش دیگر سنتز، مقدار مناسبی از سویه های مقاوم در 50 میلی لیتر محیط SW با pH معادل 7/2 تلقیح شد و به مدت 7 روز در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتی گراد با سرعت 150 دور در دقیقه انکوبه گردیدند.
سپس مقداری از محلول ذخیره نیترات نقره با غلظت نهایی 0/5 میلی مولار داخل سوسپانسیون میکروبی افزوده شد و محلول فوق در شرایط تاریکی و دمای محیط قرار گرفت. به طور همزمان نمونه های کنترل منفی - محیط کشت به همراه محلول ذخیره نیترات نقره - و کنترل مثبت - کشت میکروبی سویه ها به تنهایی - در شرایط یکسان مورد ارزیابی قرار گرفتند . در صورت مشاهده تغییر رنگ در هریک از سوسپانسیون های میکروبی، بیومس سویه های تولید کننده نانوذرات نقره با استفاده از سانتریفیوژ با سرعت 10000 دور دردقیقه به مدت 10 دقیقه جداسازی شد. بیومس بدست آمده سه بار با آب دیونیزه شست و شو داده شد . محلول رویی جمع آوری گردید و با سرعت 10000دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد.
رسوب بدست آمده در آب دیونیزه حل گردید و محلول حاصل جهت اندازه گیری جذب نوری توسط اسپکتروفوتومتری UV-vis در دامنه 300-800 نانومتر مورد بررسی قرار گرفت.جهت شناسایی مولکولی سویه های سنتزکنده نانوذرات نقره، استخراج DNA ژنومی سویه ها با استفاده از روش Marmur - 1961 - انجام شد. سپس تکثیر ژن - 1500 bp - 16S rRNA و واکنش PCR با استفاده از آغازگرهای 21F و 1462R صورت گرفت و تایید صحت استخراج DNA ژنومی و واکنش PCR با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز انجام گردید. پس از مشاهده باند مناسب بر روی ژل الکتروفورز، محصول PCR جهت تعیین توالی به شرکت Macrogen - south korea - ارسال گردید.
-3 نتیجه گیری و بحث
در مجموع 301 جدایه پروکاریوت نمک دوست افراطی از سه نمونه نمک، خاک و آب نمک حوضچه برداشت نمک پلاژ تیس چابهار در محیط کشت SW جداسازی شد که بر اساس ویژگی های مورفولوژیکی کلنی و شکل میکروسکوپی 50 سویه متفاوت آرکی نمک دوست انتخاب گردید - شکل . - 1
