بخشی از مقاله
مطالعه برهمکنش پروتئین لیزوزیم با کارکومین در حضور نانوذرات نقره توسط اندازه گیری پتانسیل زتا
چکیده
هدف از این مقاله مطالعه تاثیر حضور نانو ذرات نقره در برهم کنش پروتئین لیزوزیم با کارکومین است. به منظور بررسی تاثیر حضور نانو ذرات در برهم کنش پروتئین و لیگاند، اندازه گیری پتانسیل زتا پروتئین لیزوزیم و کارکومین در حضور و غیاب نانو ذرات نقره در دمای ۸۹۲ درجه کلوین گرفته شد. نتایج بیان می کنند در حضور نانوذرات نقره، افزودن لیگاند در غلظت های ابتدایی موجب افزایش نیروهای الکترواستاتیک و تشکیل کمپلکس بین لیزوزیم و کارکومین می شود و این در حالی است که در غیاب نانوذرات نقره افزودن غلظت های کم لیگاند موجب کاهش در پتانسیل زتا و افزایش نیروهای آب گریز می شود. می توان نتیجه گرفت حضور نانو ذرات نقره منجر به افزایش نیروهای الکترواستاتیک و تشکیل کمپلکس پروتئین-لیگاند می شود. از روش پراش پرتوی رزونانسی هم استفاده شد که افزایش پراش در این روش نشان دهنده افزایش اندازه پروتئین و تشکیل کمپلکس و یا تشکیل رسوب در محیط است، درغیاب نانو ذرات میزان پراش کمتری مشاهده شد. در نمودار استرن - ولمر شیب نمودار میزان تمایل پیوند لیگاند را به پروتئین نشان می دهد و افزایش شیب نمودار در حضور نانو ذرات نقره نقش قابل توجه این ذرات را در برهم کنش پروتئین و لیگاند نشان می دهد.
کلمات کلیدی: لیزوزیم، کارکومین، نانو ذرات نقره، اندازه گیری پتانسیل زتا، پراش پرتوی رزونانسی.
۱. مقدمه
۱-۱- پروتئین لیزوزیم١
1
لیزوزیم، که با عنوان مورامیداز یا ان استیل مورامیک هیدرولاز نیز شناخته می شود، یـک آنـزیم گلیکوزیـدازی اسـت و آنزیمی است که از طریق کاتالیز هیدرولیز پیوندهای ۴،۱- بتا بین نواحی -N استیل مورامیک اسـید و -N اسـتیل- -D گلوکوزآمین در یک پپتیدوگلیکان و بین نواحی -N استیل- -D گلوکوزآمین در چیتودکسترین ها دیواره سلولی باکتریایی را تخریب می کند ] ۱[، لیزوزیم در اولین سد دفاعی بدن شرکت می کند و دارای ۶ ناحیه تریپتوفان و ۳ ناحیه تیروزین در ساختار خودش است ]۲.[ لیزوزیم یک پروتئین تک زنجیره ای با ۹۲۱ آمینواسید و وزن مولکولی ۶.۴۱ کیلو دالتون است که ساختارش توسط آنالیز اشعه X مطالعه شده است، این پروتئین دارای چهار باند دی سولفید است که در حدود ۳/۰ درصـد وزن آن را قند تشکیل می دهد ]۲.[
آمینو اسید های لیزوزیم که نقش کاتالیتیکی دارند، عبارتند از : تریپتوفان (۸۰۱ ) ، اسـید آسـپارتیک (۵۷) اسـید گلوتامیـک های شماره های ۱۵ و ۵۳.
لیزوزیم در مایعات مختلف بدن، شامل سرم، ادرار و اشک وجود دارد. فعالیت ضد باکتریایی آن با هیدرولیز دیواره سلولی باکتریایی، مخصوصا مناطقی که واحدهای تکراری از -N استیل گلوکوزآمین و -N استیل مورامیک اسید آشکار شده اند ]۳.[ لیزوزیم به طور وسیعی به عنوان یک مدل آنزیمی در مطالعات آنزیمولوﮊی، زیست شناسی مولکولی، ﮊنتیک، شیمی پروتئین و ایمنولوﮊی کاربرد دارد ]۴.[ تحت شرایط طبیعی فیزیولوﮊیکی، لیزوزیم به یک ساختار کروی فشرده، با یک شکاف طویل روی سطح می پیچد.
این آنزیم دارای عملکردهای داروشناختی، نظیر ضد عفونی، ضد ورم و ضد ویروسی و ضد سرطانی است است ]۱۱[، به طوری که در هیدرولیز ترکیبات پلی ساکارید سلول های باکتریایی گرم مثبت موثر است، همچنین گردش خون انسانی را بهبود می بخشد و در نتیجه در افزایش ایمنی تاثیر گذار است ]۲.[
مطالعه برهم کنش نانو ذرات نقره در اندازه های مختلف با لیزوزیم می تواند در تصمیم گیری در مورد دوز داروهای مـورد استفاده موثر باشد.
۱- ۲- کارکومین
ترکیب اصلی زرد رنگ از ساقه زمینی پودر شده ی زردچوبه، یک پلی فنول به نام کارکومین است. در آسیا، به فراوانی از کارکومین به عنوان چاشنی و رنگ دهنده غذا استفاده می شود. همچنین فرن هاست که از این ترکیب به طور سنتی برای درمان اختلالات التهابی و بهبود جراحات استفاده می شود ]۵.[
شکل(۱) ساختار کارکومین
2
۱- ۳- نانو ذرات فلزی
نانو نشان دهنده ی ۹-۰۱ متر است. مواد در محدوده ی نانومتری (۱ تا ۰۰۱ نانومتر) تغییرات رفتاری مهمی نسبت به حالت توده ای از خود نشان می دهند. وابسته به روش سنتز و روش های آماده سازی نانو ذرات، اندازه های مختلفی از آن ها وجود دارد. نانو ذرات از طریق شش ها و یا به شکل غذاها، نوشیدنی ها و داروها به بدن وارد می شوند. این ذرات می توانند ارگان ها و بافت های بدن نظیر مغز، کلیه، قلب، خون و استخوان را تحت تأثیر قرار دهند ]۵،۶.[ نانوذرات به دلیل خواص نوری منحصر به فرد و شباهت های ابعادی به مولکول های زیستی دارای اهمیت فراوانی هستند ]۶.[
کاربرد نانوفناوری در زیست شناسی به عنوان امیدی برای درمان سرطان، حذف عفونت ها، افزایش هوش و طول عمر به شمار می رود.
۱-۳-۱- نانو ذرات نقره
امروزه نقره فلزی به شکل ذراتی با سایز کمتر از ۰۰۱ نانومتر به وجود آمده است که آن ها را نانو ذرات نقره یا نانو نقره می نامند. این ذرات خواص غیر معمول فیزیکوشیمیایی و فعالیت های بیولوﮊیکی از خود نشان می دهند. با انجام فعالیت های تحقیقاتی وسیع، به کار بردن نانو نقره به ویژه در حوزه سلامتی به صورت گسترده ای گسترش یافته است. با توجه به گزارش های تحقیقاتی، نانو نقره به عنوان یکی از مقوله های تولید که به سرعت در بازار و صنعت نانوتکنولوﮊی رشد می کند نمایان شده است. هنوز فعالیت آنتی باکتریالی قوی جهت گیری اصلی برای گسترش محصولات نانونقره می باشد.
در حال حاضر، نانوذرات فلزی خصوصیات ضد باکتریایی خود را به خاطر نسبت زیاد سطح به حجمشان به خوبی نشان داده اند. این مساحت سطحی بسیار بالای آن هاست که تماس مؤثرتری را با میکروارگانیسم فراهم می کند و از همین منظر به عنوان مواد جدید ضد میکروبی مورد توجه قرار گرفته اند. انواع مختلف نانو ذرات مثل مس، روی، تیتانیوم، فیزیوم، طلا و نقره وجود دارند، اما نانوذرات نقره به عنوان مؤثرترین ماده در برابر باکتری ها، ویروس ها و دیگر ارگانیسم های یوکاریوت شناخته شده اند
]۷.[
۲. مواد و روش کار
وسایل و دستگاههایی که در این تحقیق استفاده شدهاند به شرح زیر میباشند:
۱) دستگاه اندازه گیری پتانسیل زتا Nanoseries-zs (Malvern Instruments Ltd, UK)
۲) طیف سنج نشری Hitachi ـ مدل ۰۰۵۲ .F ۳) PH متر و سمپلر در اندازه های مختلف.
موادی که در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند شامل موارد زیر می باشند:
۱) پروتئین لیزوزیم با وزن مولکولی ۹۰/۶۳۱گرم بر مول خریداری شده از شرکت سیگمای آمریکا. ۲) داروی کارکومین با وزن مولکولی ۸۳/۸۶۳ گرم بر مول خریداری شده از شرکت سیگمای آمریکا.
3
۳) نانوذرات نقره.
۴) بافر پتاسیم فسفات با جرم مولکولی ۶۳۱ دالتون خریداری شده از شرکت مر ؛ آلمان. ۵) بافر .DMSO
۲-۱- پتانسیل زتا۲
ذره در داخل سیال دارای بار سطحی است و همواره در اطراف سطح ذره ای که درون سیال قرار گرفته است، افزایش غلظت یون های با بار مخالف دیده می شود. بنابراین یک لایه ی اضافی از این یون ها سطح ذره را احاطه می کند و لایه ای اضافی را در اطراف ذره بوجود می آورد. این لایه ی بوجود آمده به دور ذره را می توان به دو قسمت تقسیم کرد:
۱. لایه درونی که به آن لایه استرن۳ نیز گفته می شود که در آن یون ها به شدت محدود هستند و به صورت کاملا متراکم در کنار یکدیگر قرار گرفته اند.
۲. لایه بیرونی که یون ها تا حدودی از لایه ی قبلی آزادی بیشتری دارند و توانایی جابجایی آن ها بیشتر است. وقتی ذره درون سیال حرکت می کند، لایه های درونی و بیرونی اطراف آن نیز جابجا می شوند و با ذره حرکت می کنند و می توان یک فاصله فرضی بین ذره و محیط سیال تصور کرد که این فاصله فرضی همان لایه مضاعفی است که ذره را احاطه کرده است. این فاصله را اصطلاحا فاصله هیدرودینامیکی می نامند و پتانسیلی را که در این فاصله وجود دارد به نام پتانسیل زتا می شناسند ]۸.[
در واقع می توان گفت پتانسیل زتا، توزیع پتانسیل الکتریکی است که در فصل مشتر ؛ فاز جامد محلول های الکترولیت وجود دارد، این توزیع بارهای الکتریکی با آن چه در فاز مایع و در توده جامد وجود دارد متفاوت است. براین اساس جابجایی یک سطح باردار شده بر روی یک فاز مایع را پدیده الکتروکینتیک می گویند.
یکی از فاکتورهای فیزیکی اصلی در زیست شناسی، بار الکتریکی در سطح مواد است که به عوامل مختلفی از جمله موقعیت شیمیایی سطح مواد در تماس با بافت ها وابسته است. همچنین بررسی روابط بین سطوح شیمیایی و بارهای الکتریکی در یک سطح (پروتئین) برای کشف سازوکار بر هم کنش با بافت ضروری است. از پتانسیل زتا معمولا به منظور تعیین خاصیت بار الکتریکی در ۲ لایه استفاده می شود. پتانسیل زتا بر خلاف بار ذرات و یا وزن مولکولی آن ها تنها وابسته به خود ذرات نیست بلکه محیط ذرات مانند pH، قدرت یونی و حتی نوع یون های موجود در محلول هم در پتانسیل زتا تاثیر گذارند ]۹.[
pH پارامتری است که بیشترین اهمیت را در تعیین اندازه پتانسیل زتا دارد. در واقع اندازه گیری پتانسیل زتا بدون در نظر گرفتن pH محلول، ارزشمند نیست. در نظر بگیرید یک ذره با پتانسیل زتای منفی در یک سوسپانسیون قرار دارد. در صورتی که با اضافه کردن افزودنی، محیط سوسپانسیون قلیایی تر شود، ذره میل کمتری برای هم انباشتگی خواهد داشت و در نتیجه پتانسیل زتای آن منفی تر می شود. به نقطه ای از نمودار که پتانسیل زتا در آن به صفر می رسد اصطلاحا نقطه ایزوالکتریک۴ می گویند. بنابراین نقطه ی ایزوالکتریک، نقطه ای است که در آن سیستم کلوئیدی کم ترین پایداری را دارد ]۰۱.[
