بخشی از مقاله
چکیده
کمپوست کردن روشی اقتصادی و مناسب برای تبدیل ضایعات آلی با کربن بالا به مواد غنی از عناصر غذایی میباشد. سالیانه مقادیر زیادی ضایعات آلی مانند باگاس نیشکر تولید میشود که میتوان آنها را به کمپوست تبدیل کرد. ریزجانداران از جمله قارچها نقش مهمی در تجزیه کمپوست بر عهده دارند. بیشترین بخش ماندههای گیاهی ترکیبهای لیگنوسلولزی است. پژوهش حاضر به منظورجداسازی و شناسایی برخی قارچهای تولید کننده آنزیم سلولاز درگیر در تجزیه باگاس نیشکر در فرآیند تولید کمپوست انجام شد. به این منظور به ازای 50 گرم باگاس اولیه، 5گرم از هریک از نمونههای کود گوسفندی، کود برگ، کود گاوی و کمپوست قارچ اضافه شد. رطوبت نمونهها نزدیک 60 درصد وزن باگاس حفظ و برای60 روز در دمای محیط نگهداری شدند. تودهها هر 5-7 روز یک بار برای دو هفته نخست و پس از آن هفتهای یک بار برای هوادهی زیر و رو شدند.
برای جداسازی قارچها از محیط کشت عمومی حاوی رزبنگال استفاده شد. جدایههای قارچی با استفاده از روش تک اسپور کردن و نوک هیف خالص سازی شدند. برای بررسی قارچ-های مولد آنزیم سلولاز از محیط کشت جامد حاوی کربوکسی متیل سلولز استفاده شد. سویههای قارچی بر اساس خصوصیات ظاهری و بررسی میکروسکوپی تحت جنسهای فوزاریوم، آسپرژیلوس، سودوسپوریوم و آرترینیوم شناسایی شدند. بر اساس آزمون کیفی سلولاز از میان این چهار جدایه قارچی، سه جدایه از نمونه های حاوی کود گوسفندی - فوزاریوم و آرترینیوم - و کود برگ - آسپرژیلوس - با تولید 10 میلی متر هاله بیشترین و یک جدایه از نمونه حاوی کمپوست قارچی - سودوسپوریوم - با تولید 2 میلی متر هاله کمترین فعالیت سلولازی را داشتند.
کلمات کلیدی: کمپوست، سلولز، آنزیم، قارچ
مقدمه
افزایش تولید ضایعات شهری و کشاورزی در جهان مشکلات فراوانی در مدیریت ضایعات به وجود آورده است که مدیریت این مواد زائد به خصوص ضایعات کشاورزی از نظر زیست محیطی و بهداشتی از اهمیت ویژه ای برخوردار است. بنابراین فن آوری کمپوست به عنوان یک راه حل مفید برای حل مشکلات آلودگی آب و خاک و کاهش خطرات ناشی از دفع بیرویه زبالهها و یک منبع برای اصلاح خاک و کاهش استفاده از کود شیمیایی معرفی شده است - . - Salma et all, 2016 استفاده از ریزجانداران مفید خاکزی به عنوان کود زیستی به عنوان بهترین راه حل برای نگه داشتن سیتم حیاتی خاک در بخش کشاورزی مطرح است.
این کودهای زیستی به دلیل استفاده از ریزجانداران، یکی از بهترین و مناسب ترین جایگزینهای مناسب برای بخش کود شیمیایی میباشد. بنابراین فرآیند تولید کمپوست را میتوان یک فرآیند زیستی معرفی کرد که در آن ریزجانداران از جمله قارچها مهم ترین و کلیدی ترین نقش را در سرعت بخشیدن تجزیه کمپوست بر عهده دارند. هرچه قدرت این ریزجانداران از لحاظ تولید آنزیم بالاتر باشند مدت زمان فرآیند تولید کمپوست کوتاهتر و از لحاظ اقتصادی مقرون به صرفه تر میباشد . - Ryckeboer and Mergaert, 2003 - مطالعات بر روی جمعیت باکتریایی، اکتینو باکتر و قارچها در طول فرآیند کمپوست به صورت گسترده گزارش شده است.
سلولز از منابع تجدیدپذیر زیستی و فراوان ترین ترکیب بیولوژیکی است که به مقدار زیاد در پسماندهای کشاورزی دیده می شود. سلولز پلی مری خطی از واحدهای گلوکز است که با پیوندهای گلیکوزیدی بتا 4-1 به هم متصل شدهاند. از جمله خصوصیات مواد سلولزی نامحلول بودن و مقاوم بودنآنها در برابر تجزیه میباشد . - chitsan, 2008 - آنزیمهای تجزیه کننده سلولز شامل سه قسمت میباشد: اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و بتا گلوکوزیداز. ریزجاندارانی مثل باکتریها، قارچها و اکتینومیستها برای تجزیه ترکیبات سلولزی، این آنزیمها را به صورت مجزا و نیز به صورت ساختار پیچیده به هم تولید میکنند . - Schulein, 2000 -
سلولازها مهمترین آنزیمهای تجاری هستند و به طوروسیعی در صنایع مختلف غذا، نساجی، داروسازی و تخمیر الکل استفاده میشود. بزرگترین مشکل در راه کاربرد صنعتی این آنزیم، قیمت بالای و راندمان کم تولید آنهاست. بنابراین کاهش قیمت و بهبود اقتصادی تولید این آنزیم و مطالعه بر روی استخراج و افزایش توانایی آنزیم سلولاز یک برنامه تجاری کاربردی می باشد. بنابراین مطالعات و تحقیقات برروی سلولاز و یافتن سویههای میکروبی تولید آنزیم سلولاز بالاتر همچنان به طور گسترده ادامه دارد. اشرف و همکاران - 2007 - جدایههای قارچی Trichoderma، Mocur، Penicillium، Alternario، Aspergillus، Cladosporium و جدایه اکتینومیست Nocardia و جدایههای باکتریائی Bacillus، Micrococcus، Pseudomonas و Clostridium را از ضایعات سیب زمینی و میوه، باگاس نیشکر و چوب درختان جداسازی و شناسایی کردند.
یکی از ضایعات لیگنوسلولزی، باگاس نیشکر است. باگاس مادهای فیبری - تفاله - است که پس از استخراج شکر از نیشکر به صورت قطعات ریز تراشه چوب و به رنگ زرد کاهی به دست آمده، حدودا 30 تا 23 درصد وزن آن را تشکیل میدهند و عموما دارای رطوبت حدود 50 - 55 درصد میباشد . - Pourmazaheriet et al, 2013 - باگاس نیشکر به دلیل ساختار لیگنوسلولزی و غیر قابل محلول بودن آن دارای مشکلات متعددی میباشد از مهمترین مشکلات تولید نیشکر و صنایع جانبی آن، تولید پسماندهای مختلف از قبیل باگاس است که علیرغم با ارزش بودن، استفاده خاصی از آن و عموما باعث بروز مشکلات متعدد مدیریتی و محیط زیستی میشوند. در صورتی که این پسماندها میتوانند برای تولید مواد با ارزش مختلفی از قبیل کمپوست، علوفه دام و تولید کاغذ و سایر موارد به کار برده شود. یکی از مهمترین راه کارهای استفاده از باگاس و پسماندهای نیشکر در کشور، تولید کمپوست است. هدف از این پژوهش جداسازی و شناسایی برخی قارچهای تولید کننده آنزیم سلولاز درگیر در تجزیه باگاس نیشکر در فرآیند تولید کمپوست بوده است.
مواد و روشها
-1-1جداسازی و خالص سازی سویههای قارچی
این پژوهش در یک دوره 60 روزه انجام شد. به ازای 50 گرم باگاس اولیه، 5گرم از هریک از نمونههای کود گوسفندی، کود برگ و کمپوست قارچ اضافه و برای پایین آوردن نسبت کربن به نیتروژن به ازای هر تن باگاس10 کیلو گرم اوره به نمونهها اضافه شد و نمونهها در دمای 25 درجه سلسیوس نگهداری گردیدند. تودهها هر 5-7 روز یک بار برای دو هفته اول و پس از آن هفتهای یک بار به منظور هوادهی زیر و رو شد - میرزاشاهی و همکاران، 1389 و - Radhakrishnan et al, 2014 برای جداسازی قارچها از محیط کشت عمومی حاوی رزبنگال استفاده شد.به این منظور مقدار 1 گرم از هر نمونه در 9 میلی لیتر سرم فیزیولوژیک - حاوی 0/7 درصد سدیم کلرید - غوطه ور شدند.
سپس نمونهها را به مدت 30 دقیقه در انکوباتور شیکردار با سرعت تکان دادن 150دور بر دقیقه در دمای 28 درجه سیلسیوس نگهداری شدند. پس از تکان دادن، آمیخته برای 10 دقیقه به حالت سکون گذاشته شد، سپس یک میلی-لیتر از محلول رویی برداشته و به لوله آزمایش دارای 9 میلیلیتر آب مقطر افزوده و از این سوسپانسیون رقتهای متوالی - -1 - 10-8 - 10 تهیه شدند به اندازه 50 میکرولیتر از رقتهای10- 4 - 10- 8 روی تشتک حاوی محیط کشت PDA صورت زیگزاکی کشت داده - شدند، برای جلوگیری از رشد باکتری 50 میلی گرم در لیتر رزبنگال به محیط کشت اضافه شد. تشتکها به مدت 5روز در دمای -30 28 درجه سلسیوس برای ریزجانداران مزوفیل نگهداری شدند. پس از زمان ذکر شده جدایههای ظاهر شده بر روی تشکها که از نظر شکل و قوام متفاوت بودند، بر اساس منشأ جداسازی به طور جداگانه شمارهگذاری شدند. سپس خالصسازی و تک اسپور کردن جدایههای قارچی با استفاده از روش تک اسپور کردن و نوک هیف را انجام گرفت. - Gupta,2008 -
-2-1بررسیهای میکروسکوپی
کلنیهای قارچی پس از رنگ آمیزی با رنگ لاکتو فنل کاتن بلو با میکروسکوپ نوری مشاهده و از نظر ویژگیهای ریختشناسی مانند ساختار هیف، مسیلیوم و کنیدی مورد بررسی قرار گرفتند.
-3-1بررسی آنزیم سلولاز
برای بررسی قارچهای مولد سلولاز از محیط کشت جامد CMC شامل 2/5 گرم کربوکسی متیل سلولز، 0/4 گرم کربنات پتاسیم، 0/02 گرم کلرید کلسیم،0/02 گرم سولفات آهن، 0/02 گرم کلرید سدیم و 15 گرم آگار در 1000 میلیلیتر آب مقطر استفاده شد . تشتکهای حاوی قارچ تلقیح شده به مدت یک هفته در دمای 28 درجه سلسیوس نگهداری شدند. بعد از این مدت تشتکها با محلول کنگو رد 1 - %1 گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر - آغشته و به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شدند و سپس با محلول سدیم کلرید 1 نرمال به مدت 15 دقیقه رنگبری شدند. در نهایت هاله شفاف تشکیل شده در اطراف کلنیها که بیانگر فعالیت سلولازی بود اندازه گیری شد . - majiidi et al, 2011 -
نتایج و بحث
چهار جدایه قارچی از کمپوست باگاس نیشکر حاوی کود گوسفندی - دو جدایه - ، کمپوست قارچ - یک جدایه - و کود برگ - یک جدایه - جداسازی شدند. این جدایههای قارچی بر اساس خصوصیات ظاهری و بررسی میکروسکوپی از جنس فوزاریوم، آسپرژیلوس، سودوسپوریوم وآرترینیوم شناسایی شدند. بر اساس آزمون کیفی سلولاز از میان این چهار سویه قارچی، سه سویه قارچی جداشده از نمونه های حاوی کود گوسفندی و کود برگ به ترتیب با تولید 10میلی متر بیشترین هاله و یک سویه جدا شده از نمونه کمپوست قارچ با تولید 2 میلی متر هاله کمترین فعالیت سلولازی رو داشتند - شکل. - 1
