بخشی از مقاله
چکیده
باتوجه به کاربردهاي فراوان آنزیم سلولاز در بسیاري صنایع ، در این پژوهش تصمیم به تولید سلولاز به کمک قارچ تریکودرما ریسئی بر روي سوبستراهاي لیگنوسلولزي ارزان قیمت - کاه برنج وکاه گندم - به روش تخمیر حالت جامد گرفته شد .نتایج نشان داد که کاه برنج بستر مناسبی براي تولید آنزیم سلولاز بود . آنزیم سلولاز تولیدي در ٧pH = و دماي 35 درجه سانتی گراد حداکثر فعالیت آنزیمی را نشان داد . همچنین یون کلسیم موجب افزایش فعالیت سلولاز و جیوه سبب کاهش فعالیت آنزیم شد .
مقدمه
آمارهاي نشان می دهدتقریباً نیمی از محصولات کشاورزي بدون اینکه به مصرف برسد در مراحل مختلف از بین می روند و صنایع تبدیلی موجود در کشور قادر نیست که از تمامی اجزاء محصولات کشاورزي بهره مناسب و کامل را برد . - Nigam,1996 - در بخش برنج ، از هر تن برنج برداشتی یک و نیم تن کاه و کلش در مزارع به صورت ضایعات تولید می شود . از ساختار سلولزیک این ضایعات می توان به عنوان یک سوبستراي مناسب و ارزان قیمت براي مصارف زیست فن آوري خصوصا تولید سلولاز استفاده کرد - Sun,2008 and Kim,2004 - قارچها مهمترین گروه تولید کننده آنزیم سلولازهستند و مهمترین قارچهاي تولید کننده این آنزیم متعلق به جنسهاي Trichoderma و Aspergillus می باشد، که بطور گسترده مورد مطالعه قرارگرفته اند.
- Swapan,1994 - گونههاي تریکودما قارچهایی فرصت طلب، بیآزار وهمزیست گیاه هستند. اینها قارچ هایی آزادزي هستند که معمولا در خاك و اکوسیستم اطراف ریشه قرار دارند . - Zhang,2010 - در حال حاضر، مهمترین بستر کشت جهت رشد قارچهاي تولید کننده سلولز استفاده از فراورده هاي فرعی کشاورزي نظیر کاه و کلش غلات، ساقه ذرت، تفاله، پوسته یا دیگر سوبستراهاي لیگنوسلولزي میباشد - . - FAOSTAT,2006هدف از این مطالعه استفاده از بستر کاه برنج جهت تولید آنزیمهاي سلولاز با استفاده از قارچ تریکودرما رئیسی بود.
مواد و روشها
قارچ Trichoderma reesei ، میکروارگانیسم مورد استفاده در این تحقیق از کلکسیون قارچ ها و باکتریهاي سازمان پژوهش علمی و صنعتی ایران با کد PTCC 5142 به صورت آمپول لئوفیلیزه تهیه شد . براي تولید آنزیم از کاه برنج و گندم بعنوان بستر جامد استفاده شد. 10 گرم از بسترهاي فوق با 30 میلی لیتر از محلول نمکی - برحسب گرم بر لیتر - حاوي دي هیدروژن پتاسیم فسفات3/5، آمونیوم سولفات 2/45، سولفات منیزیم 7آبه0/525 ، کلرید کبالت 0/525 ، سولفات آهن7آبه 0/0087 ، سولفات منیزیم 7آبه0/0027، سولفات روي 7آبه 0/0025 و کلرید کلسیم0/0035 مرطوب گردید.
از پلیت حاوي قارچ تریکودرما بعنوان تلقیح به بستر کشت جامد استریل انتقال داده شد . سپس محیط هاي کشت گرمخانه گذاري شدند . استخراج آنزیم سلولاز تولیدي از بستر جامد توسط محلول هاي بافر صورت گرفت . فعالیت آنزیم سلولاز در قالب دو آنزیم اگزو بتا 1و4 گلوکاناز - - FP activity اندو بتا 1و4 گلوکاناز - CMCase - مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین pH و دماي بهینه فعالیت آنزیمی و اثرکاتیون ها مختلف بر فعالیت آنزیم تعیین گردید .
نتایج و بحث
نتایج حاصل از میزان تولید آنزیم در دو بستر کاه گندم و کاه برنج نشان داد که میزان تولید هر دو آنزیم سلولاز در بستر جامد کاه برنج بیشتر از کاه گندم بود - جدول - 1 همچنین نتایج نشان داد که میزان تولید آنزیم FP activity بیش از سه برابر تولید CMCase در بستر کاه برنج می باشد . Kimو همکارانش در سال2004 آنزیم سلولاز را توسط قارچ آسپرژیلوس نایجر در بسترهاي جامد کاه برنج وگندم بررسی کردند، آنها نشان دادند که میزان آنزیم تولیدي در کاه برنج نسبت به گندم بیشتر بود.
- Kim,2004 - Pandey و همکارانش درسال2006 میزان تولید سلولاز را توسط همین سوش بر روي کلش برنج بررسی نمودند . - Pandey,2006 - همچنین صارم نژاد و همکارانش در سال1383 با استفاده از قارچ نوروسپورا اینترمدیا تولید آنزیم بیشتري را درکاه برنج نسبت به گندم گزارش نمودند - صارم نژاد،. - 1383اثر محلولهاي نمکی و بافر هاي مختلف بر استخراج آنزیم سلولاز نشان داد که محلول نمک سولفات آمونیوم یک درصد براي استخراج آنزیم FP activity از سایر محلول ها ارجح بوده در صورتیکه براي استخراج آنزیم CMCase محلول بافر فسفات با ٧pH = مناسب تشخیص داده شد بطوریکه استفاده از این محلول ها 30 – 40 درصد نسبت به آب مقطر استخراج آنزیم ها را افزایش دادند - جدول . - 2
اصفهانی و همکاران درسال 1383 و Kim در سال 2004 براي استخراج آنزیم سلولاز تولیدي توسط قارچ تریکودرما ریسئی نشان دادند که آب مقطر بیشترین میزان استخراج آنزیم تولیدي را از بستر دارد - and Kim,2004 اصفهانی، Krishna . - 1383 در سال١٩٩٩ و Prema درسال 2007 براي استخراج آنزیم سلولاز تولیدي توسط باکتري باسیلوس از بستر جامد از بافر فسفات ٧pH = استفاده کردند Ncube . - Krishna, 1999 and Prema,2007 - و همکاران در سال2012 با استفاده از بافر استات ۶pH = بیشترین استخراج آنزیم سلولاز را گزارش کرده اند. - Ncube,2012 - به منظور بررسی شرایط بهینه عملکرد آنزیم پارامترهایی چون اثر pH و دما بر میزان فعالیت آنزیم و همچنین اثر کاتیون فلزات مختلف بر فعالیت آنزیم، مورد سنجش قرار گرفت . نتایج اثر pH بر میزان فعالیت آنزیم سلولاز نشان داد که بهترین فعالیت آنزیمی در ٧pH = بدست آمد بطوریکه میزان فعالیت آنزیم از 4 pH تا 7 سیر صعودي و سپس سیر نزولی داشت را نشان داد - شکل . - 1
اثرpH هاي مختلف بر میزان فعالیت آنزیم سلولاز FPase - و - CMCase
Krishna در سال1999 و همچنینPandey و همکاران در سال 2006 حداکثر میزان فعالیت و پایداري براي آنزیم سلولاز تولیدي در بستر لیگنوسلولزي را در ٧pH = گزارش کردندکه از این نظر کاملا مشابه نتایج ما بود . - Pandey,2006 and Krishna,1999 - آراسته و همکاران در سال1390 با بررسی اثر سلولاز جداسازي شده از قارچ آسپرژیلوس نایجر مشاهده کردند که بیشترین فعالیت و پایداري آنزیم در ٧pH = داشت - آراسته،. - 1390 نتایج اثر فلزات مختلف بر فعالیت آنزیم سلولاز نشان داد که بیشترین میزان فعالیت آنزیم سلولازي براي هر دو آنزیم تولیدي FPase و CMCase در حضور یون کلسیم بدست آمد و جیوه اثر ممانعت کنندگی بر فعالیت آنزیمی نشان داد.
