بخشی از مقاله
چکیده:
آکتینومیستها، بویژه گونههاي گرمادوست، به عنوان اصلیترین اجزاي میکروفلور کمپوست قارچ خوراکی تکمهاي شناختهشدهاند. این گروه از باکتريها توانایی زیادي در تولید آنزیمهاي تجزیهکننده و آنتیبیوتیکها دارند. آکتینومیستهاي گرمادوست از مراحل مختلف تهیه کمپوست با تکنیک رقیق سازي جداسازي و کشت خالص تهیه گردید. از نتایج تستهاي بیوشیمیایی و تجزیه و تحلیل الگوي برشی ژن 16SrRNA براي شناسایی جدایهها استفاده شد. توانایی تجزیه سلولز در هر کدام از جدایهها با استفاده از دو روش ارزیابی با کاغذ صافی - - Filter paper assay و ارزیابی فعالیت تجزیه کربوکسیمتیلسلولز - CMCase assay - در دما و pHهاي مختلف مورد بررسی قرار گرفت. حداکثر فعالیت آنزیمی براي هر کدام از جدایهها بر اساس میلیگرم گلوکز آزاد شده از یک میلیلیتر عصاره ناخالص براي هرکدام از سوبستراها تعیین شد. در هر کدام از روشهاي ارزیابی فعالیت آنزیمی جدایههاي با فعالیت سلولازي بالا در دما و pHهاي مختلف تعیین شدند و بر اساس نتایج بدستآمده جدایههاي مختلف داراي حداکثر فعالیت در دما و pH متفاوت بودند. جدایههاي 23 و 15 بالاترین فعالیت سلولازي را در دماي کمپوست داشتند.
کلمات کلیدي: آکتینومیستهاي گرمادوست، فعالیت سلولازي، FPU assay، CMCase assay
مقدمه:
آکتینومیستها تجزیهکنندگان خوبی بوده و از نظر کشاورزي حائز اهمیت میباشند - عبدي صوفیانی و همکاران . - 1388 آکتینومیستهاي گرمادوست، گرم مثبت و داراي فیلامنتهاي شاخهدار میباشند و در دیواره سلولی آنها میکولیک اسید وجود ندارد - فورب و همکاران . - 2002 این باکتريها به عنوان اجزاء اصلی میکروفلور کمپوست به شمار میروند و نقش مهمی در تجزیه مواد آلی در دماهاي بالا و شرایط هوازي دارند. جنسهاي مختلفی در این گروه از آکتینومیستها وجود دارد - سونگ و همکاران . - 2001 استرپتومایسسها مهمترین آکتینومیستهاي گرمادوست هستند. آنزیمهاي تولید شده توسط این باکتریها توانایی تجزیه ترکیبات پیچیده و سخت به ویژه سلولز ، لیگنوسلولز و لیگنین را دارد. این ترکیبات از اجزاي اصلی کمپوستها محسوب میشوند - لیزي 1997، بن و همکاران 2000، جانگ و چن . - 2003 سلولازها کمپلکسی آنزیمی، متشکل از سه گروه میباشند که بطور سینرژیستی با همدیگر عمل می کنند و میتوانند پیوندهاي گلوکوزیدي را هیدرولیز نمایند - زهري و همکاران . - 1384
مواد و روشها:
نمونههاي کمپوست از مرکز تحقیقات قارچهاي خوراکی دانشکده کشاورزي دانشگاه فردوسی مشهد تهیه شد. جداسازي آکتینومیستهاي گرمادوست با استفاده از تکنیک رقیقسازي و نگهداري پلیتهاي باکتري در دماي 40Cº انجام شد. تستهاي احیاي نیترات، کاتالاز، هیدرولیز اوره، اسیدفست جزئی و رنگ آمیزي گرم روي جدایهها انجام شد. باکتریها براي بررسی ظاهرکلنی و اندام هوایی روي محیط آب-آگار کشت شدند. توانایی تولید ملانین با استفاده از محیط کشت و تولید رنگیزه درهر کدام از جدایهها با استفاده از محیط کشت ISP 5 مورد بررسی قرار گرفت. واکنش زنجیرهاي پلیمراز براي ژن 16SrRNA با استفاده از پرایمرهاي عمومی fD1 و rP2 - ویزبورگ و همکاران - 1991 انجام گرفت.
به منظور شناسایی جدایههاي آکتینومیست، الگوي برشی ژن 16SrRNA براي هر کدام از جدایهها پس از هضم با آنزیمهاي MboI ,KpnI ,PstI HindIII ,SalI ,PaeI ,VspI با استفاده از نرم افزار TotalLabTL120 تهیه شد. الگوهاي برشی بدست آمده براي هر جدایه با الگوهاي بدست آمده از هضم توالیهاي معتبر آکتینومیستهاي ثبت شده در پایگاه داده NCBI که در محیط اینسیلیکو هضم شده بود مقایسه شد. با استفاده از این نتایج آکتینومیستهاي جداسازي شده شناسایی شدند. الگوي شباهت میان جدایهها با استفاده از نرمافزار NTSYSpc رسم شد.محیط کشت تولید آنزیم سلولاز با ترکیب %1 CMC - ، %0/5Yeast extract ، %0/05K2HPO4، %0/2NaCl ،%0/02MgSO4×7H2O، %0/1NH4NO3 و - %0/002FeCl3 براي تعیین فعالیت آنزیمی جدایهها استفاده شد.
مقدار پروتئین در عصاره آنزیمی ناخالص با روش برادفورد اندازهگیري شد. عصارههاي آنزیمی بدست آمده از رشد هر جدایه براي توانایی هیدرولیز سوبستراهاي، فیلتر کاغذي 1×6 سانتیمتري - واتمن شماره - 1 و کربوکسی متیل سلولز یک درصد CMC - - %1 مورد استفاده قرار گرفت. مخلوط هر کدام از سوبستراها با یک میلیلیتر عصاره آنزیمی و یک میلیلیتر بافر فسفات pH=6/5 به مدت 30، 60 و 90 دقیقه در حمام آب گرم با دماهاي 45°C تا 65 نگهداري شد. مقدار قند احیا کننده آزاد شده با استفاده از روش DNS2 - میلر، - 1959 اندازهگیري شد. فعالیتهاي آنزیمی به صورت واحد در میلیلیتر عصاره ناخالص آنزیمی گزارش شد. علاوه بر این به منظور تعیین بهترین pH براي فعالیت آنزیمی pHهاي 5/7، 6 و 6/5 نیز مورد بررسی قرار گرفت.
بحث ونتیجهگیري:
آکتینومیستها یکی از متنوعترین گروههاي باکتریایی میباشند که سالهاست به عنوان منبع مهمی براي تولید آنزیمهاي مفید تجاري و مولکولهاي زیستی فعال دارویی شناخته شدهاند - بوستی و همکاران، . - 2006 بر طبق نتایج حاصل از تستهاي بیوشیمیایی، باکتريهاي آکتینومیست جدا شده گرم مثبت، غیر اسید فست، کاتالاز مثبت و اغلب آنها اورهآز مثبت بودند.براساس نتایج بدست آمده از هضم اینسیلیکوي توالیهاي ژن 16SrRNA با استفاده از آنزیمهاي برشی، آنزیم MboI به عنوان آنزیم کلیدي در شناسایی آکتینومیستهاي جداسازي شده انتخاب شد. با استفاده از الگوي برشی بدست آمده از این آنزیم جدایهها به سه گروه متمایز دستهبندي شدند.
گروه اول طبقهبندي شده براساس الگوي برشی آنزیم MboI، توسط الگوي برشی آنزیمهاي AsnI , KpnI و SphI شناسایی شدند . تمام جدایههاي قرار گرفته در این گروه به جنس استرپتومایسس تعلق داشتند. بر این اساس جنس استرپتومایسس جنس غالب در میان آکتینومیستهاي گرمادوست جدا شده میباشد. این دسته از باکتري ها داراي نقش مهم محوري در تجزیه بقایاي گیاهی و تولید کمپوست می باشند. در گروه دوم بر اساس الگوي برشی آنزیم MboI تنها یک جدایه وجود داشت که با استفاده از الگوهاي برشی آنزیمهاي AsnI, PstI, HindIII و SphI شناسایی شد. این جدایه در جنس ترمومونوسپورا قرار گرفت.
براي شناسایی تک جدایه گروه سوم الگوي برشی آنزیم MboI، از آنزیمهاي AsnI SphI, Kpn I, HindIII, SalI و Psp14061 استفاده شد و الگوي برشی بدست آمده از این آنزیمها جدایه گروه سوم را در جنس ساکارومونوسپورا قرار داد. با استفاده از تکثیر ژن محافظت شده 16SrRNA و هضم آن با استفاده از آنزیمهاي برشی مناسب میتوان براي هر باکتري یک الگوي برشی تهیه نمود. با مقایسه الگوي برشی تهیه شده با الگوهاي برشی به دست آمده از هضم اینسیلیکو توالیهاي ثبت شده معتبر در پایگاههاي داده میتوان آکتینومیستهاي موجود در کمپوست را به راحتی به گروههاي مجزا دستهبندي کرد. الگوي شباهت جدایههاي آکتینومیست با استفاده از ماتریکس دوتایی بدست آمده از الگوي برشی ژن 16SrRNA با استفاده از نرم افزار NTSYSpc بررسی گردید. گروهبندي جدایهها بر اساس ضریب شباهت جاکاردروش خوشهاي UPGMA انجام شد.
بر این اساس جدایههاي آکتینومیست به سه دسته، استرپتومایسسها، ترمومونوسپوراساکارومونوسپورا تقسیم شدند.سلولازهاي پروکاریوتی حداکثر فعالیت را در دما و pHهاي متفاوت نشان میدهند - هک, . - 2002 نتایج فعالیت سلولازي در دماهاي 45°C تا 65 در مدت زمان 30 دقیقه در شکل1 نشان داده شده است.تغییرات دما سبب تغییر در فعالیت سلولازي عصاره آنزیمی باکتري شدهاست. میانگین دماها با هم تفاوت معنیداري نشان دادهاند و بر اساس میانگینهاي حاصل از هر دما در روشCMC بهترین دما 60°C، و در روش FPU بهترین دما 55°C معرفی میشود - . - α=0/05 در شکل 5 نمودار تغییرات فعالیت آنزیمی در برابر تغییر pH نشان داده شده است.
