بخشی از مقاله
چکیده
در این پژوهش، ابتدا شبکهي هیدروژل کیتوسان به روش اتصال عرضی کیتوسان سنتز و آمادهسازي شد و سپس عوامل موثردر سنتز بهینه شبکه هیدروژل، نظیر دما، pH، میزان عامل اتصالدهنده عرضی و قدرت یونی ارزیابی شدند. سازوکار واکنش تشکیل ژل کیتوسان نیز نشان داده شد. سپس، مقادیر کمی درصد ژل شدن، درجه تورم و غوطه وري و محتواي آب تعادلی براي شبکه هیدروژل کیتوسان بهینه تعیین و با سایر هیدروژل هاي پلی ساکاریدي مقایسه شد. پس از آن، توانایی هیدروژل کیتوسان در تخلیص و جداسازي آلبومین سرم گاوي - BSA - در شرایط بهینه نیز مورد بررسی قرار گرفت و بیشترین راندمان جداسازي آن، به منظور مقایسه آن با راندمان جداسازي به روش جداسازي مغناطیسی که امروزه متداول می باشد محاسبه شد.
کلمات کلیدي: بیوپلیمر پلیساکاریدي- شبکه هیدروژل کیتوسان - مشخصه سازي- تخلیص و جداسازي – پروتئین BSA
-1 مقدمه
هیدروژلهاي بر پایه پلیمرهاي طبیعی، خصوصا پلی ساکاریدها، به علت مزیتهاي منحصر به فرد اینگونه مواد از قبیل سمی نبودن، زیست سازگاري فوق العاده این مواد، قابلیت تجزیه زیستی از طبیعت و فراوانی و ارزانی آنها، مورد استفاده روزافزون قرار گرفتهاند. پلیمر طبیعی کیتوسان، یکی از مناسبترین موادي است که تاکنون براي این منظور شناسایی شده است . - 5 - کیتوسان، پلیمري زیست تخریب پذیر، زیست سازگار و زیست چسبنده است که توجه محققان را براي مقاصد درمانی با دامنه وسیعی از کاربردهاي دارورسانی و ژل درمانی به خود جلب کرده است. کیتوسان، همبسپاري از گلوکز و -Nاستیل گلوکز آمین است که به وسیله پیوندهاي -β1 -4 گلیکوزیدي به هم اتصال یافتهاند. این پلیمر داراي گروههاي آمین و هیدروکسیل آزاد است که میتواند منجر به تولید مشتقات مختلف از آن شود. هیدروژلها با روشهاي شیمیایی و فیزیکی سنتز میشوند. در روشهاي شیمیایی از حدواسطهایی شیمیایی براي اتصال عرضی مونومرها و پلیمرهاي با گروههاي فعال استفاده میگردد. در این مراحل، اجزاي ناخواسته، مضر و سمی در واکنشها توسط روشهاي جداسازي از محلول استخراج میشوند . - 1 -
-2 مواد و روش ها
-1-2 اتصال عرضی فرمالدهید با کیتوسان و تشکیل شبکهي هیدروژل
براي تهیه هیدروژل کیتوزان، میزان 0/2 گرم کیتوزان را در نه بشر 100 میلی لیتري ریخته و سپس به هر کدام از نمونهها، 14 میلی لیتر از محلول خالص اسید استیک گلاسیال %1 را اضافه کرده و به خوبی حل مینماییم. سپس، مقادیر متفاوتی از محلول فرمالدهید 5 مولار را به هریک از محلولها اضافه کرده و وزن نهایی هر محلول را با استفاده از آب مقطر به 24/2 گرم میرسانیم. محلولهاي ساخته شده را به مدت 6 ساعت نگهداري نموده تا به طور کامل از ژل شدن آنها مطمئن شویم.
-2-2 تغییرات خواص هیدروژل با عوامل متفاوت هیدروژلهاي کیتوسان، هیدروژلهاي یونیزه شده میباشند و بنابراین رفتار و تغییرات خواص آنها وابسته به هر دو عامل ساختار شیمیایی و نوع محیط میباشد. درجه تورم هیدروژلهاي در تعادل، با افزایش غلظت گروههاي عاملی قابل یونیزه در شبکه هیدروژل و کاهش مقدار اتصال عرضی در فرایند سنتز، افزایش می یابد . - 4 -
-3-2 بررسی خواص هیدروژل هاي کیتوسان -1-3-2 درصد ژل شدن : یکی از معیارهاي مهم جهت تشخیص کیفیت هیدروژل، درصد ژل میباشد. آزمایش تعیین درصدژل طبق روش کیونگ رانپارك و همکاران، انجام گردید . - 3 - براي تعیین میزان ژل تشکیل شده در هیدروژلها، نمونههاي ژل تشکیل شده را پس از خشک کردن، وزن نموده و در پارچه توري قرار داده و در آب دو بار تقطیر و با دماي 60 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت غوطهور مینماییم. پس از طی این مدت نمونه را در آون با دماي 60 درجه سانتیگراد خشک نموده تا به وزن ثابت برسد. درصد ژل از رابطه زیر به دست میآید.
-2-3-2 درجه تورم و غوطه وري: یکی از خصوصیات این دسته از پلیمرها، جذب آب یا مایعهاي فیزیولوژیک بدن و سپس متورم شدن آنها میباشد. این آزمایش طبق روش دارویس و همکاران انجام شد . - 2 - هر نمونه را پس از وزن کردن، در پارچه توري قرار داده و سپس در آب دو بار تقطیر به مدت 48 ساعت در دماي اتاق نگهداري می نماییم تا ژلها کاملا متورم گردند. در مرحلهي بعدي ژلهاي متورم را وزن نموده و در آون با دماي 60 درجه سانتیگراد خشک کرده تا به وزن ثابت برسند. سپس آنها را وزن کرده و از رابطه زیر درجه تورم تعیین می گردد.
-3-3-2 میزان آب تعادلی یا هیدراته شدن: منظور از آب تعادلی، مقدار آبی است که ژل در شبکه پلیمري خود نگه میدارد و در واقع هیدراته شدن هیدروژل را نشان میدهد. هر نمونه را در پارچه توري قرار داده و در آب دو بار تقطیر در دماي اتاق غوطه ور نموده تا زمانی که ژل پس از جذب آب به وزن ثابت برسد. سپس، نمونه را وزن نموده و در آون با دماي 60 درجه سانتیگراد خشک کرده تا پس از خشک شدن به وزن ثابت برسد و سپس از رابطه زیر میزان آب تعادلی به دست می آید.که در روابط فوق، برابر با وزن ژل پس از خشک شدن، بیانگر وزن ژل اولیه و نیز وزن ژل متورم می باشند.
-4-2 استفاده از ژل کیتوسان در تخلیص و جداسازي پروتئین BSA
براي تخلیص یک پروتئین وجود روشی براي شناسایی و تعیین مقدار پروتئین موردنظر در حضور تعداد زیادي از مواد محلول و نامحلول دیگر ضروري است. باید تخلیص را با آگاهی از اندازه و ویژگیهاي فیزیکی پروتئین و یا کسري از جرم پروتئین تام نمونه که به آن پروتئین مربوط است، انجام داد. در این بخش با استفاده از شبکهي هیدروژل کیتوسان، پروتئین آلبومین سرم خون گاوي را از محلول تخلیص مینماییم. ابتدا ژل را در ظرفهاي کوچک ستون مانند - با ابعاد تقریبی 300× 10 میلیمتر - بستهبندي مینماییم. سپس، به ژل موردنظر آب مقطر اضافه مینماییم تا شستشو شود. اندکی صبر میکنیم تا تعادل میان آنها برقرار شود . نمونه 20 - BSA میلیگرم بر میلیلیتر، و به حجم 1 میلیلیتر - را در بافر تعادلی حل نموده و به ستون اضافه و ستون را از آن پر مینماییم.
پیشرفت فرآیند شویش ستون با گذشت زمان توسط دستگاه آشکارساز پروتئین نشان داده میشود. محلول حاصل از شویش نیز در پایین ستون جمعآوري میشود. مساحت پیکها بعد از هر مرحله شویش، راندمان جداسازي پروتئین را نشان میدهد. بر اساس قرداد بین المللی، 1 واحد فعالیت پروتئین، مقدار پروتئین لازم جهت تغییرسوبسترا در زمان یک دقیقه و دماي 25 °C میباشد. اصطلاح فعالیت به تعداد کل واحدهاي پروتئینی موجود در یک محلول اشاره دارد. فعالیت ویژه تعداد واحدهاي پروتئینی موجود در هر میلیگرم از پروتئین تام است. فعالیت ویژه معیاري از خلوص پروتئینی به حساب میآید که در حین تخلیص یک پروتئین افزایش میآید و با خالص شدن پروتئین به حداکثر مقدار خود و به یک حالت ثابت میرسد. فاکتور تخلیص در هر مرحله نیز برابر با نسبت فعالیت ویژه پروتئین پس از هر مرحله تخلیص به فعالیت ویژه آن، قبل از شروع آن مرحله از تخلیص تعریف میشود.
-3 نتایج و بحث
-1-3 بررسی خواص هیدروژل هاي کیتوسان کیتوسان به آسانی با فرمالدهید توسط سازوکار بازشیف اتصال مییابد. از دادههاي جدول ذیل مشخص میباشد که به ازاي استفاده از 7 میلیلیتر فرمالدهید، بیشترین درصد ژل شدن به دست میآید. از نمودارها نیز واضح میباشد که مقادیر درجه تورم و محتواي آب تعادلی هیدروژلها، با افزایش عامل اتصال عرضی تا یک نقطه معین افزایش مییابند و پس از آن با افزودن مقادیر اضافی عامل اتصال عرضی، کاهش مییابند. همچنین، نشان داده می شود که افزایش قدرت یونی سبب ادامه کاهش در میزان تورم هیدروژلها در هر دو pH اسیدي و بازي میشود.
محتواي آب تعادلی هیدروژلها با افزایش دما افزایش مییابد. از این رو میتوان گفت که، تنها تعداد زیاد گروههاي آمینوي غیرفعال، معیار اصلی براي دستیابی به بیشترین مقدار محتواي آب کل نمی باشد، بلکه میزان اتصال عرضی نیز یک پارامتر تعیینکننده براي دستیابی به آن در سطوح مختلف pH میباشد. این یک پدیدهي متداول و شناخته شدهاي است که معمولا در هیدروژلهاي یونی مشاهده میشود. این موضوع، اغلب به اثر پوششی بار آنیونهاي اضافه شده نسبت داده میشود که سبب دفع ناقص برخورد الکترواستاتیک بین آنیونها و کاتیونها میشود و کاهش تفاوت فشار اسمزي بین شبکه هیدروژل و محلول خارجی و چروكخوردگی ژل را منجر میشود.
