بخشی از مقاله
چکیده
در این پژوهش، ابتدا نانوذرات سوپر پارامغناطیس Fe3O4 به روش همرسوبی معکوس سنتز شدند و سپس اندازه ذرات با استفاده از روش تفرق دینامیکی نور و روش پراش اشعه ایکس تخمین زده شد. مورفولوژي نانوذرات نیز توسط دستگاه میکروسکوپ الکترونی عبوري مورد ارزیابی قرار گرفت. سپس، شبکهي هیدروژل کیتوسان به روش اتصال عرضی کیتوسان با فرمالدهید آمادهسازي شد و نانوذرات مغناطیسی Fe3O4 بر روي شبکهي هیدروژل تثبیت شدند که توسط میکروسکوپ نیروي اتمی نشان داده شد.
سپس، پروتئین BSA نیز در شبکه هیدروژل – نانوذره تثبیت شد و با نانوذرات تشکیل کمپلکس داد. به علت خاصیت مغناطیسی نانوذرات، کمپلکس نانوذره – پروتئین نیز خاصیت فوق را دارا می باشد. بنابراین می توان با استفاده از خاصیت مغناطیسی کمپلکس، توسط روش جداسازي مغناطیسی، آن را از شبکه هیدروژل و یا محلول پلی ساکاریدي جداسازي نمود. نتایج نیز یک مقدار قابل توجه از راندمان جداسازي با استفاده از شبکهي هیدروژل – نانوذره را نشان دادند که در مقایسه با روش هاي متداول جداسازي بسیار موثرتر می باشد. علاوه بر آن، این فرایند جداسازي ساده میباشد و در نمونهي شبکهي هیدروژل-نانوذره، به علت استفاده از یک آهنرباي ساده براي جداسازي موثر میباشد.
-1 مقدمه
در سالهاي اخیر فناوري نانو براي تثبیت آنزیمها و پروتئینها مورد توجه قرار گرفته است. اما در بیوتکنولوژي صنعتی، تثبیت آنزیم بر روي نانوذرات مشکل است چون در واقع مدیریت و بازگرداندن نانومواد به وسیله سانتریفیوژ و فیلتراسیون از لحاظ اقتصادي مقرون به صرفه نمیباشد.
از این رو، اخیرا استفاده از نانوذرات مغناطیسی براي تثبیت پروتئینها و بهویژه آنزیمها و سپس جداسازي مغناطیسی آنها مورد توجه خاصی قرار گرفته است . - 3 - روشهاي جداسازي زیادي براي جداسازي مولکول هاي ویژه وجود دارد که بر پایه انتخابی بودن و بازیافت استوار است. جداسازي مغناطیسی بسیار سریعتر و بهتر از روشهاي کروماتوگرافی و سانتریفیوژي بوده و مولکولهاي هدف را از محلول هاي ناخالص آن جداسازي میکند. اغلب، زمانی که با جداسازي در حجم زیادي از محلول سروکار داریم، نانوذرات مغناطیسی مفیدتر میباشند.
-2 مواد و روش ها
-1-2 سنتز نانوذرات مگنتیت Fe3O4 به روش هم رسوبی معکوس
در روش هم رسوبی دو نحوه افزودن مواد به یکدیگر وجود دارد: روش هم رسوبی نرمال و روش هم رسوبی معکوس. روش هم رسوبی معکوس از مخلوط محلولهاي نمک آهن دو و سه ظرفیتی که روش دما پایین و تک مرحله اي است و کنترل شرایط سنتز در آن دشوار نمی باشد، به دلیل آسانی و با قابلیت تکرارپذیري، مقرون به صرفه بودن و عدم نیاز به تجهیزات خاص و گران، بسیار مورد توجه قرار گرفته است و جزو روشهاي عمده سنتز میباشد. به منظور سنتز نانوذرات، در ابتدا، محلولهاي آبی کلرید آهن - II - ، کلرید آهن - III - و همچنین محلول آمونیاك ، به طور جداگانه و با غلظتهاي به ترتیب 2، 1 و 1 مولار تهیه گردیدند.
سپس دو محلول آبی کلرید آهن - II - و کلرید آهن - III - به منظور به دست آوردن نسبت اختلاط بهینه، به نسبت هاي مختلف با یکدیگر مخلوط شده و 100 میلی لیتر محلول آمونیاك در دماي ثابت 35 °C و در شرایط هم خوردن شدید، به صورت قطره قطره به محلول فوق اضافه و بطور همزمان pH محلول نیز کنترل گردید. افزودن مواد تا pH حدود 10 ادامه یافت. مشاهده شد که با افزودن مواد، رنگ محلول به تدریج مشکی می شود که این حاکی از تشکیل مگنتیت می باشد.
بعد از اتمام افزودن مواد، همزدن سوسپانسیون حاصل شده به منظور یکنواختی و تکمیل واکنش به مدت 1 الی 2 ساعت ادامه یافت. سپس، رسوب مشکی رنگ حاصله فیلتر و توسط یک آهنربا جمع آوري شد. پس از چند مرتبه شستشوي رسوب با آب مقطر و اتانول، آنگاه نانوذرات به دست آمده به مدت 12 ساعت و در دماي 55 °C خشک گردیدند. واکنش کلی سنتز مگنتیت به روش همرسوبی از مخلوط محلول هاي نمک آهن دو و سه ظرفیتی به صورت زیر می باشد :
-2-2 تثبیت نانوذرات مغناطیسی Fe3O4 و پروتئین BSA بر روي شبکهي هیدروژل
هیدروژلهاي مغناطیسی پیوندي توسط تهنشین نمودن ذرات مغناطیسی اکسیدآهن به درون شبکه هیدروژل پلیساکاریدي، از طریق واکنش کاهش کلریدآهن - II - چهار آبه و کلریدآهن - III - شش آبه در حضور هیدروکسید سدیم و در دماي اتاق تهیه میشوند. یک نمونه ژل خشک را در آب دو بار تقطیر قرار میدهیم و اجازه میدهیم تا به طور کامل متورم شوند. سپس، هیدروژل تورم یافته را به یک ظرف آزمایشگاهی دیگر که دربردارندهي محلول مختلط کلریدآهن - II - چهار آبه و کلریدآهن - III - شش آبه - نسبت مولی - 2:1 میباشد، انتقال می دهیم و 24 ساعت صبر می نماییم تا به تعادل برسند
بمنظور تولید کمپلکس پروتئین – نانوذره، ابتدا نانوذرات اکسید آهن موردنظر تا مرحلهي تشکیل رسوب سیاه رنگ سنتز میشوند. سپس، رسوب را سانتریفوژ مینماییم و آن را درون حلال هیدروکربنی تولوئن پراکنده میکنیم. همزمان نیز فرایند تثبیت پروتئین بر روي نانوذرات صورت مییابد. بدین صورت، نانوذرات مغناطیسی آماده و به ماکروملکولهاي زیستی متصل شده و تثبیت و جداسازي این ماکروملکولها تحت میدان مغناطیسی مهیا میشود
-3-2 جداسازي پروتئین BSA توسط شبکه هیدروژل مغناطیسی
در آزمایشات جداسازي، ما از جداکننده مغناطیسی الکترومگ استفاده مینماییم که براي جداسازي انواع جاذبهاي با کشش مغناطیسی به کار میرود. 50 میلیگرم از هیدروژل هیبریدي مغناطیسی خشک را در 5 میلیلیتر از محلول BSA با غلظت هاي مختلف - و با قدرت یونی یکسان و برابر با 0/1 مولار - و در شرایط pH برابر با 7/4 قرار میدهیم. به منظور پیوستگی سطحی بهتر پروتئین بر روي سطح هیدروژلها، غلظت پروتئین باید کمتر از %1 باشد. محلول سوسپانسیون آبی، شامل بافر فسفات 50 - میلیلیتر بافر در pH برابر با - 7/4 میباشد. سپس، مخلوط بدست آمده را تحت دماي 20 درجه سانتیگراد در شیکرانکوباتور قرار میدهیم تا به خوبی همزده شوند.
اندکی صبر مینماییم تا هر یک از اجزاي مخلوط به تعادل برسند. هیدروژل را از شیکرانکوباتور خارج کرده و آنگاه، محلول سوسپانسیون آبی را که شامل نانوذرات مغناطیسی نیز میباشد را تحت یک میدان مغناطیسی برابر با 30 ولت قرار میدهیم تا هیدروژل از محلول دفع شود. با تکرار این روش جداسازي مغناطیسی، ذرات با آسیبپذیري مغناطیسی کمتر، در مدت 10 تا 20 دقیقه به سمت یک صفحه عمودي مسطح در الکترومگ دفع میشوند.
ذرات مغناطیسی قويتر در دیواره صفحه تجمع مییابند، در حالیکه ذرات با خاصیت مغناطیسی کمتر یا ذرات غیرمغناطیسی در بخش تحتانی صفحه تجمع مییابند. اندکی از ذرات نیز شاید در سوسپانسیون باقی بمانند. در پایان، با استفاده از یک پمپ پریستالتیک طراحی شده در جداساز الکترومگ، تقریبا 2 لیتر آب براي دفع کامل ناخالصیهاي غیر مغناطیسی و شستشوي دستگاه پمپاژ میشود و فرایند جداسازي مغناطیسی کامل میشود . - 2 -
-3 نتایج و بحث
-1-3 بررسی و شناسایی نانوذرات مغناطیسی سنتز شده نانوذرات مغناطیسی اکسیدآهن سنتز شده توسط دستگاه میکروسکوپ الکترونی عبوري شناسایی و اندازه تقریبی آنها و فاز نمونهها به وسیله تکنیکهاي پراش اشعه ایکس و تفرق دینامیکی نور بررسی شدند . نتایج موجود بواسطه مطابقت آن با الگوي استاندارد Fe3O4 حاکی از سنتز نانوذره فوق است. قطر نانوذرات Fe3O4 بدست آمده توسط روش پراش اشعه ایکس برابر با 9/80 nm می باشند. براي بررسی مورفولوژي سطح و اندازه دقیق نانوذرات، از میکروسکوپ الکترونی عبوري استفاده شد که قطر ذرات توسط دستگاه فوق برابر با 15 نانومتر نشان داده شد.
شکل -1 اندازه نانوذرات مغناطیسی تولید شده توسط تکنیک XRD
شکل -2 اندازه نانوذرات مغناطیسی از طریق روش تفرق دینامیکی نور و تصویر TEM نانوذرات سنتز شده Fe3O4 در مقیاس 100 نانومتر
در شکل فوق، MV قطر میانگین حجمی، MN قطر میانگین عددي و MA قطر میانگین سطح مقطع برحسب نانومتر، CS مساحت سطح ویژه بر حسب مترمربع بر سیسی - m2/cc - ، SD انحراف معیار و مابقی مربوط به نتایج آماري می باشد . همان طور که از جدول مشاهده میشود، با استفاده از روش تفرق دینامیکی نور، قطر نانوذرات برابر با 30 نانومتر به دست آمدند.
جدول -1 نتایج حاصل از روش تفرق دینامیکی نور
