بخشی از مقاله
خلاصه:
مقدمه: InvH یکی از اجزاي اصلی تیپ ترشحی سه در باکتري سالمونلا است. این ژن به صورت اختصاصی در سالمونلا وجود دارد.هم چنین این پروتئین در لایه ي پپتیدو گلیکان باکتري می تواند به عنوان یک آنتی ژن موثر تولید آنتی بادي را در حیوان آزمایشگاهی تحریک کند.
هدف: هدف از این پژوهش استفاده از ژن InvH براي تشخیص سریع سالمونلا با استفاده از تکنیک PCR و هم چنین استفاده از سرم تولید شده بر علیه پروتئین InvH براي تشخیص سالمونلا از طریق تکنیک الایزا می باشد.
روش: ابتدا PCR با ژنوم استخراج شده از سالمونلا انتریتیدیس و سپس با کلنی گونه هاي سالمونلا انجام شد.در مرحله ي بعد الحاق ژنPCR به وکتور بیانی ، بیان و تخلیص پروتین نوترکیب و تزریق آن به حیوان آزمایشگاهی ونهایتا تهیه سرم و انجام الایزا با پروتئین نوترکیب و گونه هاي سالمونلا انجام شد.
نتیجه:نتایج PCR نشان دهنده وجود این ژن در گونه هاي مورد آزمایش بود ونتایج الایزا نیز اتصال آنتی بادي به سطح گونه هاي مورد آزمایش را تایید کرد و قابلیت هر دو روش براي تشخیص سالمونلا مورد تایید قرار گرفت.
مقدمه:
گونه هاي جنس سالمونلا ، باکتري هاي گرم منفی، بی هوازي اختیاري متحرك بدون تخمیر لاکتوز ، میله اي شکل و جز خانواده آنتروباکتریاسه است.سالمونلا ها به طور کلی انسان و حیوانات را به واسطه مسیر oro _faecal آلوده می سازد. این میکروارگانیسم در فاضلاب ،دریا و آب رود خانه به مقدار زیادي یافت شده و توانایی آلودگی سازي تنوع وسیعی از غذا ها را دارد.سالمونلا از تعداد زیادي از گونه هاي حیوانی شامل گاو،جوجه بوقلمون و غیره جداسازي شده است.عفونت هاي سالمونلایی یکی از مشکلات جدي در پزشکی و دامپزشکی در سطح جهان می باشد.
براي مثال Salmonella Thyphimurium باعث آلوده سازي احشام و خوك می شود و Salmonella Enteritidis و Salmonella Thyphimurium باعث آلوده سازي گوشت ماکیان وتخم مرغ می شوند که در نهایت به عنوان منبع عمومی ایجاد گاسترو آنتریت حاد در انسان ها شناخته می شود. - 5 - ارگانیسم مسبب ایجاد تب تیفوئید Salmonella Typhi و Salmonella Paratyphiتیپ هاي A, B مسئول ایجاد تب پارا تیفوئید می باشند.
Salmonella Enteritidis - 3 - به عنوان عامل اصلی بیماري هاي حاصل ازتغذیه و به عنوان بیماري مشترك بین انسان و دام به صورت عامل پاندمیک بسیار مهم تحت شرایط طبیعی معرفی می گردد. . - 2;6 - روش هاي متفاوتی براي تشخیص سالمونلا مورد استفاده قرار می گیرد .که عبارت از روش کشت Immunoassay، و روش هاي مولکولی PCR، Real-time PCR اشاره کرد.که در این کار تحقیقی هدف استفاده از PCR به عنوان یک روش ملکولی و هم چنین الایزا به عنوان یک روش ایمونولوژیک براي تشخیص سالمونلا می باشد.ژن InvH مختص جنس سالمونلا بوده و داراي 444 نوکلوتید و جزیی از ژن هاي جزیره پاتوژنی سالمونلا می باشد.
- . - 4 نقش این ژن در تهاجم و هم چنین اتصال باکتري به سلول هاي دیواره ي روده با مطالعه ي گونه هاي جهش یافته اثبات شده است. - - 7این ژن مختص جنس سالمونلا بوده و در تمام گونه هاي این جنس بجز Salmonella arizonae مشاهده می گردد. - - 1 از این ویژگی می توان براي شناسایی این جنس از طریق روش PCR استفاده نمود.هم چنین وجود این پروتئین در ساختار کمپلکس سوزنی، تیپ سه سیستم ترشحی سالمونلا،و خاصیت آنتی ژنی این پروتئین ،استفاده از آن را براي تشخیص سالمونلا از طریق تست الایزا فراهم می سازد.
مواد و روش ها
در این پژوهش از سه سویه ي سالمونلا،سالمونلا تیفی - - PTCC1609، سالمونلا انتریتیدیس، سالمونلا تیفی موریوم وهم چنین اشرشیاکلی - ATCC43889 - استفاده شد. بسیاري از مواد مورد نیاز از شرکت سینا ژن تهیه شد.آنتی بیو تیک هاي مورد نیاز از شرکت Roche تهیه شد.ناقل بیانی pET28a از شرکت Novagene خریداري شد.آنزیمهاي محدودالأثر EcorI , Hind IIIو آنزیمهاي T4 DNA Ligase ،آنزیمهاي DNA پلیمراز Taq و Pfu از شرکت ژن فناوران - Fermentas - تهیه شدند.
سویه مورد استفاده جهت تهیه سلولهاي مستعد E.coli Bl21-DE3 موجود در آزمایشگاه تحقیقاتی دانشگاه شاهد مورد استفاده قرار گرفت.براي تخلیص پروتئین نوترکیب از ستون Ni-NTA agarose resin استفاده شد که از شرکت کیاژن - QIAGENE - خریداري شد. موش آزمایشگاهی سوري نژاد BALB/C ،ادجوانت ناقص و کامل فروند از موسسهي رازي تهیه شد.
.1تعیین ترادف ژن طراحی پرایمر
ترادف ژنInvH با عدد دست رسیAM 933172 از پایگاه اینترنتی NCBI استخراج شد و براي این ژن یک جفت پرایمر طراحی شد با توجه به این که توالی دو آنزیم محدودالاثر EcoRI,HindIII در انتهاي این دو پرایمر قرار داده شده اند. - جدول - 1
.2کشت استرین استخراج ژنوم
براي کشت این باکتريها از محیط 1LB مایع و محیط جامد LB استفاده شد.براي حفظ نمونه ها با اضافه نمودن گلیسرول در فریزر -70 از نمونه ها نگهداري شد.براي این آزمایش ژنوم با روش فنل کلروفرم از باکتري سالمونلا انتریتیدیس استخراج شد و سپس با استفاده از روش PCRژن InvH از ژنوم استخراج و کپی برداري شد. محصولات هضم آنزیمی براي الحاق قطعه به وکتور بیانی pET28a به مدت 16 ساعت در دماي 14-12 درجه سانتیگراد قرار داده شد.مقادیر واکنش الحاق به صورت - وکتور خطی شده 2 میکرو لیتر ،قطعه 6 میکرو لیتر ، آنزیم لیگاز 2 میکرو لیتر بافر آنزیم لیگاز 2 میکرو لیتر ، آب دو بار یو نیزه 8 میکرو لیتر، جمع کل واکنش 20 میکرو لیتر - در نظر گرفته شد.
بیان پروتئین نوترکیب و ایمن زایی:
جهت تراریخت2 نمودن پلاسمید نوترکیب به درون سلو لهاي مستعد از روشی دستی انتقال استفاده شد.براي تولید پروتئین نوترکیب، باکتري تراریخت شده با pET 28a-InvH در محیط LB و در دماي 37 درجه سانتی گراد بر روي شیکر با حداقل 170 دور در دقیقه کشت داده شدند.پس از اینکه باکتري ها به تعداد مناسب - OD=0.6 - رسید.از محلول یک مولار IPTG به سوسپانسیون باکتري اضافه شد تا غلطت نهایی IPTG به یک میلی مولار برسد.16 ساعت بعد از افزودن IPTG ، رسوب باکتري با سانتریفیوژ در 6000 دور دقیقه به مدت 15 دقیقه جمع آوري شد.
