بخشی از مقاله
چکیده:
یکی از مهمترین محصولات منطقه شمال ایران چاي - Camellia sinensis - L. - O. Kuntze - میباشد. تنوع ژنتیکی 18 ژنوتیپ برگزیده از منطقه غرب مازندران در این بررسی توسط 10 نشانگر مولکولی ISSR مورد بررسی قرار گرفت.
دادههاي حاصل توسط NTSYS مورد تجزیه قرار گرفتند.
آغازگرهاي بکار رفته تعداد 99 باند در کل تکثیر نمودند که 82 باند حالت چندشکل نشان دادند. میزان درصد چندشکلی کل و محتواي چند شکل به ترتیب 82/83 و 0/47 محاسبه گردید و دامنه تشابه بدست آمده از 0/38 تا 0/95 با متوسط 0/64 بود. بر اساس تجزیه کلاستر نمونهها در تشابه % 57 به چهار گروه تقسیم شدند. نکته مهم در این گروهبنديها اختلاط بالاي ژنوتیپها بود که به دلیل گرده افشانی آزاد و تکثیر بذري در گذشته میباشد. بر اساسی دادههاي حاصل میتوان بیان نمود که تنوع بالایی مابین ژنوتیپهاي چاي تحت کشت در ایران وجود دارد.
مقدمه:
درخت چاي به عنوان یکی از مهمترین محصولات نوشیدنی غیر الکلی در بسیاري از کشورها مطرح است. زادگاه این گیاه یونا در کشور چین میباشد که در خود منبع غنی از تنوع ژنتیکی را قرار داده است. سه واریته بذر عمومی Dhonjan،Rajghu و Betjan پایه و اساس ژنتیک چاي ایران را تشکیل میدهند.
با توجه به آنکه نشانگرهاي مولکولی کمتر تحت تاثیر فاکتورهاي محیطی قرار میگیرند و همچنین از نظر تعداد نامحدود میباشند، کاربرد آنها در شناسایی و بررسی روابط ژنتیکی گیاهان بسیار رایج و متداول است. از نشانگرهاي مولکولی متعددي مانند - 8 - AFLP، - 3 - RFLP، 3 - ISSR، 4 و - 9 و 2 - RAPD، 7 و - 9، - 5 - SRAP و PCR-RFLP ژنوم کلروپلاست - 6 - براي بررسی تنوع ژنتیکی چاي درگذشته استفاده شده است. در مطالعه حاضر نویسندگان کاربرد نشاگر ISSR را براي انگشتنگاري 18 ژنوتیپ چاي برگزیده از منطقه غرب مازندران را بررسی نمودهاند.
هدف کلی مطالعه پیش رو شناسایی تنوع ژنتیکی برخی ژنوتیپهاي چاي در منطقه لاهیجان به عنوان مرکز تولید چاي کشور میباشد تا از این راه بتواند به حفاظت و نگهداري ژرمپلاسم موجود چاي کمک نموده تا بتوان در طراحی برنامههاي اصلاحی آینده از آنها استفاده نمود.
مواد و روشها:
مواد گیاهی و استخراج :DNA
برگهاي جوان بالغ از 18 ژنوتیپ چاي برگزیده از منطقه غرب مازندران تهیه شده و تا زمان استفاده در فریز -80 درجه سانتیگراد نگهداري شدند. جهت استخراج DNA از روش CTAB با تغییرات جزئی استفاده شد. جدول 1 اسامی و کد بندي نمونههاي مورد بررسی را نشان میدهد.
جدول -1 مواد گیاهی مورد استفاده در پژوهش
آنالیز :ISSR
تعداد 18 عدد آغازگر ISSR براي این بررسی بر روي نمونهها و جهت بهینه سازي و انتخاب بهترین آغازگرها مورد بررسی قرار گرفت که در نهایت ده عدد از آنها که بهترین، قويترین و تکرار پذیرترین تکثیر را داشتند، جهت ادامه بررسی برگزیده شدند. جهت اجراي واکنش زنجیرهاي پلیمراز - PCR - ترکیب مواد در داخل هر واکنش شامل DNA الگو 50ng، بافر PCR - 10X - به میزان µ25/1l، کلرید منیزیم 2mM، از هر dNTP به میزان 0/2mM، آنزیم Taq پلیمرازبه میزان 1 واحد و µ75/0M از آغازگر بود که در نهایت توسط آب مقطر به حجم µ5/12l رسانده شد.
شرایط انجام واکنش زنجیرهاي پلیمراز براي آغازگرها نیز به صورت زیر تنظیم شد: ابتدا محلول واکنش به مدت 4 دقیقه در دماي 94 درجه سانتی گراد قرار گرفت سپس این محلول وارد مرحله دوم گردید که این مرحله به صورت 35 چرخه و شرایط به این صورت تنظیم گردید: 95 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه، 37 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه و 72 درجه سانتی گرادبه مدت یک دقیقه بود و در نهایت براي تکثیر و گسترش نهایی محلول واکنش در دماي 72 درجه سانتی گراد به مدت هفت دقیقه نگهداري شد. سپس نمونهها در دماي 4 درجه سانتی گراد تا زمان الکتروفورز نگهداري شدند.
تجزیه آماري:
محصولات تکثیر شده به نسبت 5 میکرولیتر محصول PCR، 3 میکرولیتر بافر بارگذاري و 2 میکرولیتر ژل رد در ژل آگارز 1/5 درصد تحت ولتاژ ثابت 90 ولت به مدت 120 دقیقه تفکیک گردیدند و زیر نور UV توسط دستگاه ژل داك بیومترا - Biometra - از ژل حاصل عکس برداري شد.فقط باندهاي تشکیل شده کاملا مشخص و مطمئن امتیازدهی دایس تشکیل گردید و تجزیه خوشهاي نمونهها با الگوریتم UPGMA صورت گرفت.محتواي اطلاعات چندشکلی 1 - PIC - بر
شدند - حضور - 1 - یا عدم حضور - صفر - - . بعد از تشکیل ماتریس صفر و یک و انتقال آنها به نرم افزار NTSYSver 2.1e ماتریس ضریب تشابه اساس رابطه PICi=2fi - 1-fi - که براي نشانگرهاي غالب توصیه شده است، محاسبه شد.
نتایج و بحث:
سودمندي نشانگر :ISSR
به منظور بررسی تنوع ژنتیکی 18 ژنوتیپ چاي از روش ISSR استفاده شده است. از میان 18 آغازگر ISSR آزمون شده روي چهار نمونه انتخاب تصادفی، تعداد 10 آغازگر که داراي بهترین تکثیر بودند انتخاب شدند. جدول 2 اطلاعات توالی آغازگرهاي بکار رفته، تعداد باندهاي تکثیري، تعداد باندهاي چند شکل، درصد چند شکلی و محتواي اطلاعات چند شکلی را نشان میدهد.
تعداد کل باندهاي تکثیر شده براي آغازگرهاي بکار رفته 99 باند بود که از این تعداد، 82 باند حالت چندشکلی و 17 باند حالت یکنواختی داشتند. متوسط باند به ازاي هر آغازگر برابر 7/6 باند بود. تعداد باندهاي چندشکل حاصل از بررسی ژنوم توسط نشانگرهاي ISSR در دامنه 6 الی 12 با متوسط 6/3 باند بود. با توجه به تعداد باندهاي کل و باندهاي چند شکل، درصد چند شکلی نیز محاسبه گردید که این میزان در دامنه %63/64 تا %100 بود. درصد چند شکلی کل نیز برابر 82%/83 محاسبه شد. با توجه به نتایج سایر بررسیهاي مشابه بر روي گیاه چاي 1 - ، 4 و - 9 این میزان درصد محاسبه شده، قابل قبول است.
جدول -2 لیست آغازگرهاي ISSR مورد استفاده براي تعیین تنوع ژنتیکی 20 ژنوتیپ چاي، در صد چندشکلی حاصل
از آنها و میزان محتواي اطلاعات چندشکلی - PIC -
تجزیه و تحلیل کلاستر:
بر اساس دادههاي حاصل از نشانگر ISSR ضریب تشابه SM محاسبه و توسط الگوریتم UPGMA نمونهها مورد تجزیه کلاستر قرار گرفتند. در ماتریس تشابه حداکثر میزان تشابه مابین دو ژنوتیپ G50 و G19 به میزان 0/95 و حداقل میزان تشابه به میزان 0/38 مابین دو نمونه G41 و G56 بدست آمد. متوسط میزان تشابه نیز % 64 محاسبه شد. در کلاستر بدست آمده در سطح تشابه حدود %74 نمونهها در پنج گروه قرار گرفتند. شکل - 2 - نمودار حاصل از دادههاي ISSR و نحوه قرار گیري نمونهها را نشان میدهد. گروه اول شامل یک عضو، گروه دوم شامل چهار عضو، گروه سوم داراي دو عضو و گروه چهارم که بزرگترین گروه بود شامل 11 عضو باقی مانده بود.
