بخشی از مقاله
چکیده
آرتریت روماتوئید - RA - یک بیماري شایع التهابی سیستمیک خود ایمنی است و عامل نکروز توموري آلفا - TNF-α - نقش مهمی در ابتلا به RA دارد. اتانرسپت ETN - ، نام تجاري - ®Enbrel یکی از داروهاي ضد TNF است که توسط فنآوري DNA نوترکیب در سلولهاي تخمدان هامستر چینی تولید میشود. در سالهاي اخیر، گیاهان به عنوان یک سیستم بیان کننده جذاب براي تولید اقتصادي پروتئینهاي دارویی نوترکیب به طور گستردهاي مورد پذیرش قرار گرفتهاند.
در تحقیق حاضر، یک سازه بیانی نوترکیب براي تولید کارآمد ETN در گیاه توتون ساخته شد. ژن TNFRS1B بهینه سازي شده با کدونهاي ترجیحی توتون که ETN را رمز میکند، در وکتور بیانی دوتایی pBI121 همسانهسازي شد. براي بیان سطح بالاي ژن TNFRS1B، پروموتر CaMV 35S با یک ناحیه تقویت کننده دوبل شده و همچنین ناحیه غیرترجمه شونده 5' ژن chalcone synthase در کاست ژنی نیز استفاده شد.
براي تسهیل خالص سازي از عصاره گیاه با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی، یک برچسب - His6 tag - hexahistidine در انتهاي C پروتئین ETN نیز قرار داده شد. همچنین جایگاه برش آنزیم پروتئازي TEV از ویروس جغجغه توتون - tobacco etch virus - به توالی His6 براي حذف برچسب از پروتئین نوترکیب نهایی، متصل شد. درستی ساختار سازه با استفاده از آنالیزهاي PCR و برش آنزیمی تایید شد. وکتور نوترکیب حاصل میتواند در مطالعات آینده براي بیان و تولید ETN در سامانه تنباکو استفاده شود.
مقدمه
آرتریت روماتوئید - Rheumatoid arthritis; RA - یا روماتیسم مفصلی، یک بیماري سیستمیک و مزمن و التهابی است که شایعترین نوع آرتروز خود ایمنی است. میزان شیوع آرتریت روماتوئید، در حدود یک درصد جهانی و در ایران تقریبا 25 درصد برآورد شده است و در این میان زنان تقریباً سه برابر مردان مبتلا به این بیماري میشوند و این میزان با بالا رفتن سن افزایش مییابد . - firestein et al.¸ 2001: Rennie et al.¸ 2003 - اتانرسپت - Etanercept - با نام تجاري انبرل - Enbrel - یک گلیکوپروتنین است که به عنوان یک ایمونومودولاتور براي درمان بیماریهاي سیستم ایمنی مانند آرتریت روماتوئید به کار میرود.
اتانرسپت یک پروتئین ترکیبی دیمر است، که داراي قسمت خارج سلولی پذیرنده Tumor necrosis factor - TNF-α - alpha انسانی 75 کیلو دالتونی میباشد که به قسمت Fc از ایمونوگلوبولین IgG1 متصل شده است. این پروتئین مهارکننده عملکرد عامل نکروز تومور آلفا است. TNFα سایتوکاینی است که توسط منوسیتها و ماکروفاژها تولید میشود و موجب افزایش انتقال گلبولهاي سفید به محل التهاب میگردد. بدین ترتیب و با به کارگیري برخی مکانیزمهاي دیگر مولکولی، موجب افزایش التهاب میشود .اتانرسپت با مهار این مکانیزم موجب کاهش پاسخهاي التهابی میگردد که مشخصاً در درمان بیماریهاي خودایمنی مؤثر میباشد
پیشرفتهاي اخیر در مهندسی ژنتیک بیان موفق پروتئینهاي نوترکیب درمانی با ارزش در گیاهان را امکانپذیر ساخته است.
از مهمترین مزایاي گیاهان به عنوان رآکتورهاي زیستی سبز براي تولید پروتئین نوترکیب میتوان به هزینههاي پایین تولید، افزایش مقیاس سریع و کارآمد، تولید فرآوردههاي طبیعی، پایداري بیشتر و همچنین عدم وجود خطرات ناشی از آلودگی با عوامل بیماريزا اشاره کرد
با این حال، استفاده از گیاهان به عنوان سیستم میزبانی هنوز هم با دو محدودیت اصلی مواجه است: تجمع کم برخی از پروتئینهاي نوترکیب و عدم وجود روشهاي خالصسازي کارآمد. یکی از راهکارهاي مهم براي افزایش انباشت پروتئینهاي نوترکیب در گیاهان استفاده از یک سازه بیانی قدرتمند 5´UTR و همچنین استفاده از برچسب هایی در انتهایی C- terminal پروتئین هدف براي خالص سازي تک مرحله اي آن با استفاده از روش کروماتوگرافی گرایشی را فرآهم می کند. در این تحقیق سازه بیانی گیاهی حاوي ژن TNFRSF1B رمز کننده پروتئین اتانرسپت به منظور تولید پروتئین نوترکیب TNF2 در یک میزبان گیاهی مانند توتون ساخته شد.
مواد و روشها تهیه دستواره نوترکیب
به منظور ساخت سازه مولکولی حاوي ژن TNFRSF1B ، ابتدا قطعهاي از پلاسمید pUC57-TNF2 با آنزیمهاي برشی NheӀ و SacӀ برش داده شده و در پلاسمید pBI-ZAsn - حاوي راه انداز ر ویروس موزائیک کلم تقویت شده دوبل، CaMV 35S x2e و ناحیه غیرترجمه شونده ژن چالکون سینتاز، - CHS 5´UTR درج شد. بدین ترتیب سازه نوترکیب حاوي ژن رمز کننده تحت کنترل راه انداز 35S 2x ساخته شد. محصول واکنش اتصال به روش ذوب و انجماد - Howlader et al.¸ 2013 - به باکتري E. coli سویهي DH5α انتقال داده شد. جهت انتخاب کلونیهاي حاوي پلاسمید نوترکیب از آنتیبیوتیک کانامایسین µg/ml - - 50 در محیط کشت LB استفاده گردید.
نتایج و بحث
تایید دستواره نوترکیب
حضور ژن TNFRSF1B در پلاسمید pBI-TNFRSF1B، که سلولهاي مستعد باکتري E. coli با آن تراریخت شده بودند، با آنالیز با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی براي کلونیهاي تراریخته احتمالی - شکل - 1A تایید شد. در PCR مطابق انتظار قطعهاي به طول 1350bp تکثیر شد و به این ترتیب کلونیهاي باکتري نوترکیب حاوي ژن TNFRSF1B غربال اولیه شدند
برش پلاسمید نوترکب pBI-TNFRSF1B توسط آنزیمهاي NheӀ و SacӀ - هر کدام داراي یک چایگاه برش -
باعث ایجاد قطعه اینزرت مربوط به ژن TNFRSF1B با اندازهاي تقریبی 1600 bp شد که دقیقا هم اندازه قطعه خارج شده از پلاسمید pUC57-TNF2 برش یافته با آنزیمهاي برشی NheI و SacI یعنی همان قطعهي اینزرت بود. نتایج حاصل از برش آنزیمی صحت سازه نوترکیب ساخته شده pBI121-TNFRSF1B - شکل - 2 را تایید نمود.
شکل -1 آنالیز ساختار سازه نوترکیب - A .pBI121-TNFRS1B کلونیهاي باکتري نوترکیب حاصل از ترانسفورم واکنش لیگاسیون مربوط به ساخت سازه نوترکیب در محیط کشت انتخابی حاوي کانامایسین، - B آنالیز Colony-PCR برایکلونیهاي حاوي سازه pBI121-TNFRS1B با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی. :M نشانگر مولکولی 1 kb DNA Ladder - Fermentas - ، :1-3 کلونیهاي تراریخته حاوي پلاسمید نوترکیب p pBI121-TNFRS1B، :4 واکنش PCR بدون DNA الگو - شاهد منفی - . :5 پلاسمید p57-TNFRS1B - شامد مثبت - . نوار 1350 bp تکثیر بخشی از ژن رمز کنندة اتانرسپت را نشان میدهد. - C آنالیز هضم پلاسمید نوترکیب با انزیمهاي :1, 2 .NheI+SacI برش سازه نوترکیب pBI121-TNFRS1B، :3 , 4 برش سازه .p57-TNFRS1B قطعه 1600 bp حاصل از برش همان قطعه اینترزت است که در ساخت سازه نوترکیب هدف از پلاسمید p57-TNFR1SD استفاده شده بود.
شکل -2 نقشه فیزیکی بخش T-DNA پلاسمید نوترکیب :LB .pBI121-TNFRSF1B توالی مرزي چپ، RB: توالی مرزي راست، :nptII ژن neomycin phosphotransferase، :Nos-T توالی پایانی ژن nos، :Nos-P راهانداز ژن nos، CaMV 35S x2e : راهانداز ویروس موزائیک کلم تقویت شده، : 5´UTR ناحیه غیرترجمه شونده ʹ5 ژن چالکون سنتاز، :TNFRSF1B ژن رمز کننده اتانرسپت، :HisTag-Tev جایگاه تشخیص آنزیم TEV همراه با برچسب .6x His
در سازه ژنی تهیه شده در این تحقیق از واریانت تقویت شده راهانداز - 35S 2xe - CaMV 35S استفاده شد. این راهانداز داراي تکرار پشت سرهم یک بخش بالادست به اندازه 250 bp است که این بخش تکرار شده به عنوان یک تقویت کننده پروموتر هترولوگوس بوده و باعث افزایش فعالیت رونویسی ژن به اندازه دهها برابر نسبت به راهانداز معمول میشود
نواحی ترجمه نشده 5ʹ و5ʹ UTR - 3 ´ و - 3ʹ UTR با تاثیر بر پایداري mRNA، موضعیابی و کارایی ترجمه نقش بسیار مهمی در تنظیم بیان ژن در سطح پس از رونویسی ایفا میکنند
