بخشی از مقاله
چکیده
اصلاح ساختار ریشه میتواند با بهبود رشد، استقرار در خاك، جذب آب و مواد مغذي و بیوسنتز اسیدهاي آمینه، هورمونها و غیره به افزایش عملکرد دانه و کیفیت مطلوب بذر منجر شوند و با استفاده کارآمد از مواد مغذي، مقاومت به ورس و تحمل به خشکی، مرتبط است. با در نظر گرفتن بحران کم آبی در کشور، تولید گیاهان متحمل در برابر خشکی حائز اهمیت خواهد بود.
در این پژوهش بهبود صفات ریشه از طریق ساخت سازه ترکیبی از ژنهاي کاندید تغییردهنده معماري ساختار ریشه با منشا گیاهی مدنظر قرار گرفت. ژنهاي OsExpa8، OsNac5 و Dro1 برگرفته از ارقام وحشی برنج طی مراحلی تحت پیشبر مختص ریشه و پیشبر دائمی بر اساس ماهیت ژن کاندید همسانهسازي و در ناحیه T-DNA ناقل دوگانه اگروباکتریومی قرار داده شدند. صحت ساخت سازه چند ژنی حاصل با استفاده از هضم آنزیمی و واکنش زنجیرهاي پلیمراز مورد تایید قرار گرفت.
انتظار بر این است بیان ژن Dro1 باعث تغییر زاویه رشد ریشه و تولید ریشه عمیق شده و با بیان ژن OsNac5 تحت پیشبر ریشه، بتوان تعداد و قطر ریشه برنج را افزایش داد و سبب افزایش محصول تحت شرایط نرمال و تنش شد. همچنین ژن OsExpa8 کاندیدي براي افزایش طول ریشه، ریشههاي جانبی و تارهاي کشنده است. سازه حاصل به آگروباکتریوم سویه EHA105 تراریزش و تایید شد.
سازه چند ژنی حاصل را میتوان با هدف تغییر ساختار ریشه و تحمل به خشکی براي انتقال ژن به گیاهان مورد استفاده قرار داد. در حال حاضر انتقال به جنینهاي نارس برنج در حال انجام است. امید است تولید برنج تراریخته با تغییر ساختار ریشه بتواند تحمل به خشکی را در محصولات مهم زراعی افزایش و سبب کاهش مصرف آب در کشت محصولات به ویژه برنج شود.
مقدمه
ریشه اندام ضروري براي بهرهبرداري از منابع خاك، مانند مواد غذایی و آب است. ریشه برنج سطحی و افشان بوده و حداکثر در عمق 20 تا 25 سانتیمتري خاك نفوذ میکند که مستعد تنش خشکی به دلیل داشتن ریشه سطحی در میان غلات است.
ارقام مختلفی از برنج وجود دارد که سیستم ریشه بسیار متفاوتی دارند. به عنوان مثال رقم KP - Kinandang patong - ، ریشهدهی عمیقی را نشان داده است. یکی از مهمترین راهکارهاي مقابله با بحران کمبود آب استفاده هرچه مفیدتر و کارآمدتر از آب آبیاري است که تغییر ساختار ریشه و افزایش طول، عمق، تعداد و ضخامت آن میتواند تحمل به کم آبی را در پی داشته باشد.
DRO1 - ژن عامل بوجود آوردن ریشه عمیق - ، صفت پیچیدهاي است که ترکیبی از اثرات زاویه رشد ریشه، طول ریشه اولیه و ریشه گرهی محصولات زراعی است. انتقال DRO1 به یک رقم برنج با ریشه کم عمق لاین حاصل را قادر ساخت تا از خشکی توسط افزایش عمق ریشهدهی اجتناب کند و این امر منجربه حفظ عملکرد بالا در شرایط تنش خشکی در مقایسه با رقم اولیه شاهد شد. در تحقیق مذکور، بیوماس و طول ریشه تغییر چندانی نداشت ولی میزان محصول نهایی - دانههاي پر شده - در تنش خشکی متوسط و شدید حدود%30 افزایش نشان داد
در مطالعه دیگري نیز بیش بیان ژن پاسخگو به تنش OsNAC5، تحمل به خشکی، شوري زیاد و دماي پایین در گیاهان تراریخته را افزایش داد Takasaki - و همکاران، 2010؛ Song و همکاران، - . بیش بیان OsNAC5 که یک فاکتور رونویسی را کُد میکند، در گیاه برنج، تحمل به خشکی و شوري بالا را در طول مرحله رشد رویشی بهبود داد و مهمتر اینکه بیش بیان این ژن فقط در ریشه بهطور معنیداري تحمل به خشکی را در مرحله باردهی از طریق رشد ریشههاي بزرگ با افزایش عملکرد دانه افزایش داد.
ببیان OsExpa8، رشد برنج و ساختار آن را با سرعت بخشیدن به گسترش سلولی بهبود میدهد. با بیان OsExpa8 به طور قابل توجهی کشش و توسعهپذیري سلولها افزایش یافته و در ترکیب دیواره سلولی تاثیر میگذارد و افزایش رشد ریشههاي مویین را به همراه دارد
هدف از این تحقیق طراحی و ساخت سازهاي چند ژنی حاوي ژن هاي کاندید تغییر دهنده معماري ساختار ریشه مناسب براي انتقال ژن به گیاهان با هدف تحمل به خشکی است.
مواد و روشها
ساخت سازه چند ژنی حاوي ژنهاي OsExpa8، OsNac5 وDro1
در این تحقیق که در بخش مهندسی ژنتیک و ایمنیزیستی پژوهشگاه بیوتکنولوژي کشاورزي انجام شد از سازههاي تک ژنی حاوي ژنهاي تغییردهنده صفات ریشه و تحمل به خشکی که قبلا توسط نگارنده مسئول ساخته شده بود، براي ترکیب ژنها و تهیه سازه چند ژنی استفاده شد. به طور خلاصه با به کارگیري آنزیمهاي برشی داراي انتهاي سازگار - compatible ends - کاستهاي ژنی در ناحیه T-DNAي پلاسمید اگروباکتریومی همسانهسازي شدند. طراحی سازههاي ژنی با استفاده از نرم افزار - Invitrogen - Vector NTI انجام شد.
واکنش اتصال قطعات مورد نظر به صورت غیرمستقیم - در حاملهاي کلونسازي تحت پیشبر ریشه - و یا به صورت مستقیم در حاملهاي دوگانه انتقال ژن مختص اگروباکتریوم انجام و مخلوط اتصال به سلولهاي مستعد تهیه شده از E. coli سویه XLI-Blue منتقل شد و روي محیط انتخابی LB حاوي آنتیبیوتیک مناسب بر اساس نوع حامل مورد استفاده رشد داده شد. اثبات تراریختی پس از استخراج پلاسمید از کلونیهاي حاصل، با استفاده از هضم آنزیمی و PCR انجام گرفت. کلیه مراحل کلونسازي و آنالیزهاي مولکولی با استفاده از دستورالعملهاي سمبروك و راسل - 2001 - انجام شد. پلاسمید نوترکیب سه ژنی حاصل پس از تایید به روش آن و همکاران - 1986 - به اگروباکتریوم سویه EHA105 منتقل شد.
ساخت پلاسمید نوترکیب
پلاسمید نوترکیب حاصل موسوم به pGH-Rcc3-Nac5
ساخت سازه نوترکیب pGH-Rcc3-Nac5
پلاسمیدهاي pGH-Nac5 حاوي ژن OsNac5 و pGH-RCc3 حاوي کاست داراي پیشبر مختص ریشه به طور جداگانه با آنزیمهاي BamHI و SalI هضم و قطعه 1002 جفتبازي Nac5 تحت پیشبر RCc3 درون حامل pGH همسانهسازي شد.
با هضم آنزیمی و واکنش زنجیرهاي پلیمراز مورد بررسی صحت حامل نوترکیب pGH-RCc3-Nac5 با استفاده از آنزیمهاي برشی KpnI و XbaI هضم شده و قطعه حاوي کاست ژنی OsNac5 تحت پیشبر مختص ریشه با طول 4810 جفتباز از روي ژل آگارز خالص سازي شد. این کاست Rcc3-Nac5- - - Tahsp-ubi با استفاده از آنزیمهاي KpnI وSpeI در کنار کاست ژنی Dro1 و OsExpa8 قرار گرفت که هر یک جداگانه تحت پیشبر یوبیکوئیتین قرار داده شده بودند.
نتایج و بحث
ساخت سازه نوترکیب pGH-Rcc3-Nac5
ژن OsNac5 که پس از بهینهسازي کدونی و حذف جایگاههاي آنزیمی درونی بدون تغییر در اسیدآمینه و با حفظ چارچوب بازخواندنی - ORF - در حامل pGH-Nac5 قرار داشت پس از هضم با آنزیمهاي BamHI و Sal1، قطعات مورد انتظار 2923bp و 1002bp را روي ژل آگارز نشان داد. پلاسمید حدواسط دیگري که به منظور قرار دادن ناحیه کدکننده ژن - CDS - تحت پیشبر RCc3 طراحی شده بود موسوم به pGH-RCc3 نیز با استفاده از آنزیمهاي مذکور هضم و پس از تایید باندهاي مورد انتظار 6742bp و 1624bp، قطعه اول حاوي پیشبر اختصاصی ریشه - Rcc3 - ، خاتمه دهنده - Tahsp - و پیشبر دائمی Ubi به عنوان حامل جهت همسانهسازي ژن OsNac5 خالصسازي و مورد استفاده قرار گرفت.
کلونیهاي نوترکیب روي محیط انتخابی حاوي 100 میلیگرم بر لیتر آمپیسیلین رشد کردند و پس از استخراج پلاسمید با هضم آنزیمی مورد تایید قرار گرفتند. بدین ترتیب سازه نوترکیب موسوم به pGH-RCc3-Nac5 به دست آمد - شکل . - 1 این سازه که حاوي ژن OsNac5 تحت پیشبر مختص ریشه است مناسب براي انتقال ژن به گیاهان از طریق تفنگ ژنی است. انتظار بر این است گیاهانی که ژن مذکور را تحت پیشبر ریشه دریافت کنند نه تنها در شرایط نرمال بلکه در شرایط تنش خشکی افزایش محصول را به دنبال داشته باشند. این ژن که یک تنظیمکننده رونویسی است ریشه هاي طویل تر و افزایش در اندازه استل و کورتکس ریشه را به همراه خواهد داشت.
