بخشی از مقاله
چکیده
در بین نشانگرهای ژنتیکی، توالییابی ژنوم میتوکندری یکی از بهترین و رایجترین روشها برای طبقهبندی ژنتیکی جمعیتها و گونههای نزدیک به هم، بررسی امکان اشتقاق گونههای مختلف از یک جد مشترک، مطالعه رابطه فیلوژنی هر موجود با سایر گونهها و نژادها و دستیابی به راهکارهایی برای حفظ ذخایر ژنتیکی میباشد. تحقیق حاضر به منظور تعیین توالی ناحیه ND4 ژنوم میتوکندری گاومیش خوزستان که با استفاده از 30 عدد نمونه خون از هر دو جنس از گاومیشهای غیر خویشاوند جمعآوری شده بود، انجام شد.
پس از استخراج DNA ، ناحیه مورد نظر توسط پرایمرهای اختصاصی با تکنیک PCR تکثیر و پس از خالصسازی توالییابی شدند. سپس توالی نواحی ND4ژنوم گاومیش خوزستان با توالی ناحیه مشابه از ژنوم گاومیشهای سایر نژادهای دنیا، مقایسه شد و نتایج نشان داد که جایگاه ND4 گاومیشهای بومی خوزستان نزدیک به گاومیشهای ایتالیایی هستند.
مقدمه
منشاء گاومیشهای خوزستانی به خوبی معلوم نیست ولی به نظر میرسد که از گاومیشهایی از هندوستان باشند که از گاومیش وحشی بوبالوس آرنی1 حاصل شدهاند. از لحاظ شکل ظاهری نیز گاومیشهای جنوبی و گاومیشهای هندوستان شبیه یکدیگر هستند و احتمالا تفاوتهای جزیی بین آنها به دلیل تفاوتهای محیطی است که در طول زمان با آنها تطابق حاصل کردهاند . - 2 - این گاومیشها عمدتاً برای تولید شیر نگهداری میشوند و در شرایط بهینه تغذیه و مدیریت، دارای خصوصیات تولیدی مناسب هستند و میتوانند روزانه به طور متوسط 8 تا 12 لیتر شیر تولید نمایند.
متوسط درصد چربی شیر گاومیشهای اکوتیپ خوزستانی 7 تا 9 درصد است. در جنوب غرب کشور، در روستاهای اطراف خرمشهر، آبادان و شادگان، روستاییان به پرورش و نگهداری گاومیش اشتغال دارند. در این نواحی بیشتر گاومیشها به صورت گلههای بزرگ و کوچک نگهداری میکنند که تعداد گاومیشهای موجود در هر گله برخی مواقع از ده رأس و گاهی بیش از پنجاه رأس است
در بین مارکرهای ژنتیکی، توالییابی ژنوم میتوکندری یکی از کاربردیترین روشها برای تشخیص گونهها میباشد . - 4 - میتوکندری اندامکی سیتوپلاسمی است که در بیشتر سلولهای بدن وجود دارند. این اندامک که قادر به تولید انرژی برای سلول است؛ دارای DNA حلقوی اختصاصی و مستقل از DNA هستهای است و در گونههای جانوری 37 ژن را کد میکند که شامل 13 ژن کدکننده زنجیره تنفسی، 22 ژن کد کننده tRNA و 2 ژن کد کننده rRNA است و طول تقریبی آن 16 کیلو جفت باز میباشد
شناسایی توالی این مناطق به عنوان مشخصه ژنتیکی ثابت محسوب میشود و به تهیه شناسنامه ژنتیکی و نگهداری خلوص نژادهای بومی کمک میکند و با مقایسه گونهها و نژادهای دیگر که در سالهای مختلف مطالعه شده است و توالی آنها در بانک ژن موجود است امکان مطالعات فیلوژنتیکی، بررسی اشتقاق گونهها و فاصله نسلی را فراهم میکند . - 5 - تحقیق حاضر به منظور تعیین توالی ناحیه ND4 ژنوم میتوکندری گاومیش خوزستان انجام شد.
مواد و روش
در این تحقیق نمونهگیری از 30 رأس گاومیش موجود در ایستگاه پرورش و اصلاح نژاد گاومیش صفی آباد خوزستان و چندین گله مردمی تحت پوشش امور دام استان خوزستان صورت گرفت. نمونههای خون به مقدار 5 میلیلیتر از سیاهرگ وداج گردنی، در تیوبهای حاوی ماده ضد انعقاد EDTA اخذ و تا زمان استخراج DNA در فریزر -20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. استخراج DNA با استفاده از روش اصلاح شده نمکی انجام شد. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده به روش طیف سنجی با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر Nano Drop-ND 2000 Thermo - ، آمریکا - سنجیده شد. طراحی آغازگر برای تکثیر بخشی از توالی ژن ND4 از mtDNA با استفاده از نرم افزار - Premier Biosoft ,USA - Primer premier 5 و ژنوم کامل میتوکندری گاومیش صورت گرفت
با استفاده از رویه BLAST موجود در پایگاه بانک جهانی ژن، میزان همپوشانی آنها با توالیهای موجود، مقایسه گردید. واکنش زنجیرهای پلیمراز برای تکثیر قطعه طول 1136 جفت بازی ناحیه ژنی ND4 از mtDNA توسط دستگاه ترموسایکلر Biometra مدل T-personal براساس روش استاندارد انجام گرفت. پس از آزمایش غلظتهای مختلف اجزا PCR، شرایط بهینه PCR با حجم نهایی 15 l به صورت 1x بافر PCR، Mgcl2 2 mM، 0/25 M آغازگر، dNTPs 200 M، 0/6 واحد آنزیم Taq پلیمراز و DNA الگو به میزان 150 ng بدست آمد.
برنامه حرارتی مناسب برای آغازگر مورد مطالعه به صورت: واسرشته سازی اولیه در 94 درجه سانتیگراد به مدت 8 دقیقه و 37 سیکل شامل: واسرشته سازی ثانویه در 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، اتصال آغازگرها در دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه و مرحله بسط در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه انتخاب و بسط نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه در نظر گرفته شد.
الکتروفورز محصولات واکنش زنجیرهای پلیمراز بر روی ژل آگارز 1 درصد و رنگآمیزی ژل با اتیدیوم بروماید صورت گرفت. مقدار 100 میکرولیتر از محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز، خالصسازی و به همراه 50 میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای رفت و برگشت، با غلظت 10 پیکومول به منظور تعیین توالی به شرکت MacroGen کره جنوبی ارسال گردید. این نمونهها با استفاده از دستگاه ABI 3130 به روش اتوماتیک سانگر توالییابی شدند.
سپس با استفاده از ابزار BLAST و رویه blastn در پایگاه NCBI میزان همولوژی توالیهای بدست آمده سنجیده شد. به منظور بررسی رابطه فیلوژنتیکی نژادهای مورد مطالعه، نمودار درختی با استفاده از رویه UPGMA توالیهای همردیف شده، به کمک نرم افزار - 3 - Bioedit ترسیم گردید. همچنین برای تعیین هاپلوتیپها از رویه Disparity Index Analysis نرم افزار - 6 - MEGA6 استفاده شد.
