بخشی از مقاله
چکیده
یکی از روشهای تأمین فسفر مورد نیاز گیاهان بهرهگیری از توان زیستی خاک و استفاده از میکروارگانیسمهای حلکننده فسفات می-باشد. پس از نمونهبرداری از اراضی شالیزاری گیلان، جداسازی، خالصسازی و شناسایی مورفولوژیک و مولکولی - ژن - 16S rDNA سیانوباکتریها، میزان توانایی حل کنندگی فسفات جدایهها ارزیابی شده و سپس جدایههای برتر برای کشت گلدانی گیاه برنج - رقم طارم هاشمی - انتخاب شدند. نتایج شناسایی، سویههای جداسازی شده را در چهار راسته Chroococcales، Oscillatoriales، Nostocales و Stigonematales طبقهبندی نمود.
این بررسی نشان داد که در میان جدایههای سیانوباکتری، سویه Anabaena sp. GGuCy-17 نسبت به بقیه سویهها از لحاظ اندازه حلکنندگی فسفات 641 - میکروگرم فسفر بر میلیلیتر - اختلاف معنیداری در سطح احتمال یک درصد نشان داد و بعد از آن سویه 130/4 - Cylendrospermum sp. GGuCy-25 میکروگرم فسفر بر میلیلیتر - قرار گرفت. بیشترین عملکرد دانه 15/61 - گرم در گلدان - ، بیشترین میزان جذب نیتروژن 14/3 - گرم بر کیلوگرم در گلدان - و فسفر 2/08 - گرم بر کیلوگرم در گلدان - در تیمار تلقیح شده با سویه Cylindrospermum sp. GGuCy-25 حاصل گردید. از این سویه میتوان در بهبود رشد و عملکرد برنج به عنوان کود زیستی سیانوباکتریایی استفاده کرد.
مقدمه
سیانوباکتریها یک گروه بسیار متنوع از پروکاریوتها هستند که باکتریهای اکسیژنیک و فتوتروفیک را شامل میشوند . - Madingan et al., 2012 - نقش سیانوباکتریها در حفظ اقتصاد نیتروژن خاک از طریق تثبیت نیتروژن - Singh, 1961 - و افزایش فعالیت فسفاتازی که فسفر نامحلول را به فرم محلول متحرک کرده - Mishra et al., 2005 - ، بخوبی اثبات شده است. ری و همکاران - 2013 - به اهمیت مصرف زیستتوده سیانوباکتری در کشاورزی بهعنوان کود زیستی حاوی پلیفسفات آلی - وولوتین - برای اجتناب از سمیت شیمیایی فسفر خاک نیز اشاره دارند
اگر چه شناسایی در ردهبندی سیانوباکتریی هنوز با تکیه بر خصوصیات ساده مورفولوژیک امکانپذیر است باید در نظر داشت که در دهه اخیر اطلاعات جدیدی حاصل از مطالعات فراساختاری و به خصوص بیولوژی مولکولی نقش بسیار مهمی در تحول ردهبندی این گروه از باکتریها ایفا نموده است . - Komarek et al., 2014 - به همین منظور بخشی از روند شناسایی در این تحقیق بر پایه شناسایی مولکولی قرار داده شد.
با توجه به سازگاری میکروارگانیسمها با شرایط محیط و اقلیمی زیستگاه اصلی آنها، تولید کود زیستی از باکتریهای غیربومی که از مناطقی با ویژگیهای اقلیمی متفاوت نسبت به شرایط داخلی کشور به دست آمدهاند کارایی مطلوبی نخواهد داشت
ضرورت یافتن جایگزین مناسب برای انحلال و رهاسازی فسفاتهای تجمع یافته در خاک زمانی بیشتر احساس میشود که بدانیم منابع فسفاته موجود در خاک قابلیت تأمین فسفات مورد نیاز گیاهان برای تولید بهینه آنها را تا 100 سال دارا میباشد و کافی است که این منبع عظیم فسفر را به صورتی برای گیاه قابل جذب و استفاده نمود. بنابراین، پس از جداسازی، خالصسازی و شناسایی سویههای سیانوباکتری از اراضی شالیزاری استان گیلان، آزمون حلکنندگی فسفات انجام شد و برخی سویهها برای آزمایش گلدانی انتخاب شده و عملکرد، اجزای عملکرد و میزان جذب فسفر گیاه برنج اندازهگیری شده است.
مواد و روشها
کشت نمونههای خاک مطابق روش کشت سیانوباکترییهای خاکزی انجام گرفت . - Kaushik, 1987 - شناسایی جدایهها به روش مورفولوژیک، با استفاده از میکروسکوپ نوری و کلیدهای شناسایی سیانوباکتریها Desikhachary, 1959 - ؛ - John et al., 2003 و به روش مولکولی، با استفاده از استخراج DNA به روش - 1984 - Saghai-Maroof et al. و استفاده از کیت استخراج DNA ژنومی، محصول شرکت فرمنتاز به نام - K0512 - Genomic DNA Purification Kit و دو گروه پرایمر اختصاصی 5 &** $&* - 106F - **7 *$* 7$$ &*& *7*$ 3 و - 5 *$& 7$& $** **7 $7& 7$$ 7&& &777 3 - 781Rb تعیین گردید
پس از تعیین توالی ژنی ناحیه مورد نظر، توالی ژنی حاصل با انجام عملیات BLASTn با توالی ژنهای ثبت شده در بانکهای جهانی ژن مقایسه گردید. درصد تشابه ژنی نمونه مورد نظر با نمونههای موجود در بانک ژن تعیین و صحت شناسایی نمونههای مورد نظر در سطح جنس تأئید شدند. بررسی میزان حلکنندگی فسفات هر جدایه، در محیط کشت مایع حاوی تریکلسیم فسفات 0/3 - درصد - تعیین گردید
آزمایش گلدانی برای ارزیابی پیامد کاربرد سویههای Cylindrospermum sp. GGuCy-25، Anabaena sp. GGuCy-42، Calothrix sp. GGuCy-43، Anabaena sp. GGuCy-23، Anabaena sp. GGuCy-17، Chroococcus sp. GGuCy-34 و Hapalosiphon sp. GGuCy-32 انجام گردید.
برای این کار تیمار نیتروژن صفر، 0/23، 0/35و 0/46 گرم اوره در گلدان - معادل صفر، 100، 150 و 200 کیلوگرم اوره در هکتار - با دو تقسیط و تیمار مایهزنی سیانوباکتریی با 7 سویه و تیمار شاهد بدون مایهزنی با سه تکرار آزمایش شد. آزمایش به صورت فاکتوریل و در قالب طرح پایه بلوک کامل تصادفی در پژوهشکده ژنتیک و زیست فناوری کشاورزی طبرستان انجام شد. محاسبات آماری به کمک نرم افزار SAS و مقایسه میانگین دادهها به روش آزمون چند دامنهای دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام پذیرفت.
نتایج
با انجام کشتهای اولیه نمونه در محیط کشت BG11 و BG110 و بررسیهای مورفولوژیک 30 جدایه بصورت خالص جداسازی شدند که مربوط به راسته Chroococcales، Oscillatoriales، Nostocales و Stigonematales بودند. بررسی مولکولی ناحیه ژنی 16S rDNA تعدادی ار نمونههای خالص شده و مقایسه توالیهای ژنی با توالیهای ژنی ثبت شده در بانک جهانی ژن NCBI بهواسطه انجام عملیات BLASTn، نشاندهنده وجود بالاترین سطح تشابه میان نمونههای مورد مطالعه با نمونههای ثبت شده با جنس مشابه در بانک ژن NCBI بود
قابل ذکر است که عدم تطابق برخی شواهد مورفولوژیک نمونههای بررسی شده با نتایج حاصل از مطالعه فیلوژنتیک انجام گرفته در این تحقیق امری غیرمعمول نبوده و باید در نظر داشت که در سایر مطالعات فیلوژنتیک صورت گرفته در سیانوباکترییها نیز گاه روابط ژنتیکی موجود با نتایج حاصل از ردهبندی مبتنی بر مورفولوژیک و خصوصیات فنوتیپی در تضاد بودهاند
جدول :1 نتایج حاصل از شناسایی مولکولی نمونهها با استفاده از توالی ژن 16S rDNA
مقایسه میانگین فسفر معدنی محلول شفافرویی و فسفر کل محلول شفافرویی در روزهای 15 و 30 بعد از تلقیح در سطح احتمال 5 درصد اختلاف معنیداری را نشان دادند
غلظت فسفر محلول در روز 15 بعد از تلقیح بین 53/1 تا 641 میکروگرم فسفر بر میلیلیتر متغیر بود. سویه Anabaena sp. GGuCy-17 نسبت به بقیه سویهها از لحاظ اندازه حل کنندگی فسفات 641 - میکروگرم فسفر بر میلیلیتر - برتری قابل ملاحظهای را نشان داد، و بعد از آن بیشترین غلظت فسفر محلول 130/4 - میکروگرم فسفر بر میلیلیتر - را سویه Cylendrospermum sp. GGuCy-25 نشان داد
در اغلب سویهها میزان فسفر معدنی محلول شفاف رویی محیط کشت با گذشت زمان در روز 30 ام کاهش یافت که میتواند به دلیل تغییر مرحله رشدی سویه-ها و تبدیل شدن به شکل آلی فسفر باشد چون سیانوباکترییها بهعنوان یک مخزن کارآمد برای فسفر در نظر گرفته میشوند
با توجه به اندازهگیری pH محیط کشت - جدول - ،2 عموماً سویههایی که توانایی حلکنندگی فسفر بیشتری داشتند pH محیط کشت آنها کمتر بوده است چرا که اسیدی کردن محیط با تولید اسیدهای آلی، یکی از فرآیندهای میکروبی حل شدن فسفات معدنی میباشد Mandal, 1992 - ؛ . - Yandigeri et al, 2011 تولید اسید فتالیک بهعنوان یک شیوه ممکن برای حل-کنندگی فسفر توسط سیانوباکتریها توسط یاندیجری و همکاران - 2011 - پیشنهاد شده است.
مقایسه میانگین میان تیمارها برای صفت عملکرد دانه، جدایه Cylindrospermum sp. GGuCy-25 بیشترین عملکرد 15/61 - گرم در گلدان - را داشته که از لحاظ آماری با تیمار شاهد اختلاف معنیداری داشته است 23/6 - درصد افزایش در برابر شاهد - ، بعد از آن، جدایههای Anabaena sp. GGuCy-42، Calothrix sp. GGuCy-43 و Chroococcus sp. GGuCy-34 به ترتیب بیشترین عملکرد دانه را نشان دادند.
میزان جذب عناصر غذایی نیتروژن و فسفر در اندام هوایی گیاه برنج در پایان دوره رشد در شکل 1 نشان داده شد. حداکثر جذب نیتروژن 14/3 - گرم بر کیلوگرم در گلدان - توسط سویه Cylindrospermum sp. GGuCy-25 مشاهده شد که با بقیه تیمارها اختلاف معنیداری داشت. از نظر جذب فسفر گیاه برنج تلقیح شده با سویه Cylindrospermum sp. GGuCy-25 و Anabaena sp. GGuCy-17 بهترین وضعیت را داشتند. این نتایج با یافتههای محققان مطابقت دارد
