بخشی از مقاله
چکیده
تنش خشکی یکی از مهمترین عوامل کاهش بهره وري تولید محصولات کشاورزي در سراسر جهان و همچنین ایران به شمار میرود. گیاه جو یکی از چهار غله مهم دنیاست که داراي تحمل نسبی به تنش خشکی است. پژوهش بر روي سازوکارهاي تحمل تنش در گیاه جو میتواند در درك بهتر اساس ژنتیکی تحمل به خشکی مفید واقع شود و در نهایت به بهبود خصوصیات ژنتیکی دخیل در تحمل به خشکی از طریق روشهاي نوین ژنتیک مولکولی کمک کند.تمامی ژنهاي داراي بیان افتراقی 2/5 ≥ - و - - 2/5 ≤ در بین تمامی آزمایشات ریزآرایه انجام شد، با استفاده از نرمافزار Genevestigator شناسایی شدند و آنالیز پروموتور ژنهاي شناسایی شده توسط بسته نرم افزاري Genomatix و با استفاده از نرم افزار Gene2Promoter استخراج گردید.
نتایج آنالیز پروموتر ژنهاي هاب دخیل در تحمل به تنش خشکی در اندامهاي رویشی و زایشی نشان داد که شایعترین جایگاه عوامل رونویسی به ترتیب MYB، NAC، bHLH، LIC، Zinc finger، Bzip، BCP، TCP، CCT و Heterotrimeric ، AP2 ،WRKY ،BZR ،TALE، دمین PHD هستند قابلیت اتصال به 85 درصد از پروموترها با P-Value اتصال کوچکتر از 0/05 را دارند. مطالعه این عوامل رونویسی و ژنهایی که در پروموتر خود داراي جایگاه اتصال براي این عوامل رونویسی هستند، میتواند به شناخت هر چه بیشتر سازوکار تحمل به تنش خشکی در گیاه جو کمک کند .
مقدمه
گیاه جو داراي سازگاري وسیع اکولوژیکی بوده و نسبت به سایر گیاهان خانواده غلات تحمل بیشتري نسبت به خشکی دارد. به دلیل انجام طیف گستردهاي از مطالعات فیزیولوژیکی، مرفولوژیکی و همچنین تنوع زیاد ژنومی، این گیاه به عنوان یک گیاه مدل مناسب براي بررسی تنشهاي غیر زنده انتخاب شده است - Guo, Baum et al. 2009 - یکی از تأثیرگذارترین عوامل محدود کننده محیطی این محصول تنشهاي غیر زیستی و مهمترین آنها کمبود منابع آبی و وجود تنش خشکی میباشد.
به دلیل توسعه و کشت ارقام متحمل به خشکی با استفاده از روشهاي جدید زیست فناوري امري لازم و ضروري میباشد . - Cattivelli, Rizza et al. 2008, Gosal, Wani et al. 2009, Mir, Zaman- Allah et al. 2012 - یکی از روشهاي قدرتمند براي پی بردن به مکانسیم تحمل به تنش خشکی بررسی و آنالیز عوامل تنظیمی از جمله پروموترها میباشد - Freeling and . - Subramaniam 2009 از ویژگیهاي مهم این عناصر تنظیمی حفاظت شده بودن توالی آنها در پروموتر ژنهاي اورتولوگ در گونههاي مختلف است که از این ویژگی میتوان براي شناسایی آنها در بسیاري از گونههاي مختلف بهره برد - Vilo, . - Brazma et al. 2000
از همین رو در این پژوهش تلاش شده است تا پس از گردآوري کامل تمامی ژنهاي داراي تغییر بیان بسیار بالا و پایین نسبت به تنش خشکی در جو، نحوه فعالیت ژنها از طریق آنالیز نواحی پروموترها با روشهاي بیوانفورماتیکی و شناسایی عوامل رونویسی شایع و ماژولهاي تنظیمی مشترك، به نحوه چگونگی تنظیم بیان ژنهاي شناسایی شده در تنش خشکی در گیاه جو پرداخت و به دید روشنتري نسبت به عملکرد مکانیسم پیچیده تحمل گیاه جو نسبت به خشکی با استفاده از ابزارهاي دقیق، سریع و در دسترس دست یافت.
مواد و روشها
شناسایی و استخراج ژنها
با استفاده از ابزار جستجوي ژن1 نرم افزار تحت وب Genvestigator تمامی ژنهاي داراي تغییر بیان بالاتر و مساوي 2/5 و پایین تر و مساوي -2/5 در حالت تنش خشکی نسبت به شرایط نرمال در بین تمامی آزمایشات ریزآرایه انجام شده در گیاه جو - جدول - 1، بدست آمد. این ژنهاي افتراقی از لحاظ دوره رویشی و زایشی مربوطه دسته بندي شدند. این ژنهاي افتراقی از لحاظ دوره رویشی و زایشی مربوطه دسته بندي شدند.
اورتولوگ این ژنها در گیاه آرابیدوپسیس - Arabidopsis thaliana - از طریق ابزارهاي - BLASTx - https://blast.ncbi.nlm.nih.gov و BLASTn شناسایی شد - Altschul, Gish et al. 1990, - Altschul, Madden et al. 1997، و به منظور رسم شبکه ژنی از اورتولوگهاي این ژنها در آرابیدوپسیس استفاده شد. تجزیه و تحلیل هستی شناسی 2 - GO - اطلاعات حاصل از بررسی هستی شناسی ژنهاي شناسایی شده توسط سرویس اینترنتی AgriG - /http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO - استخراج شد. ژنهاي مورد بررسی براساس فرآیندهاي زیستی3، گروهبندي و تجزیه و تحلیل شدند.
آنالیز پروموتر
توالی پروموتري اورتولوگهاي ژنهاي شناسایی شده داراي بیان افتراقی درآرابیدوپسیس، در بسته نرم افزاري Genomatix و با استفاده از نرم افزار Gene2Promoter استخراج گردید. شایان ذکر است نواحی پروموتري همه ژنها به صورت 1000 جفت باز بالادست و 200 جفت باز پایین دست از محل آغاز رونویسی ژن مورد نظر تعریف و استخراج شد.
در این بررسی، چون هدف اصلی شناسایی عوامل رونویسی کلیدي بود، به منظور تشخیص خانواده عوامل رونویسی شایع و ماژولهاي شایع که در 85 درصد از پروموترها وجود دارند با - p-value≤0.05 - به ترتیب از آنالیز Common TFs و استفاده شد. در آنالیز انجام شده میزان شباهت هسته مرکزي4عدد 1 در نظر گرفته شد و میزان ماتریس شباهت5نیز بر روي گزینه Optimized تنظیم شد.
نتایج و بحث
براساس تجزیه و تحلیل دادگان تمامی آزمایشات ریزآرایه با استفاده از ابزار جستجوي ژن در Genvestigator و پس از حذف ژنهاي تکراري به دست آمده از نمونههاي متفاوت تنش خشکی مجموعاً در اندامهاي رویشی90 ژن - حدود - %24/5 و در اندامهاي زایشی 247 ژن - حدود - %72/5 با بیان افتراقی 2/5 ≥ و-2/5 ≤ به دست آمد که تنها حدود % 3/1 از ژنها در هر دو دوره رویشی و زایشی مشاهده شدند با استفاده از اورتولوگ ژنهاي بدست آمده در اندامهاي رویشی 90 - ژن - و در اندامهاي زایشی 247 - ژن - که داراي بالاترین و پایینترین بیان در پاسخ به خشکی در گیاه جو هستند.
آنالیزهاي هستیشناسی ژنهاي شناسایی شده داراي بیان افتراقی، توسط نرم افزار تحت وب AgriGO، روشن ساخت که یکسري فرایندهاي زیستی از جمله پاسخ به محركها، تنظیم فرایندهاي زیستی، فرایندهاي متابولیسمی و جایگیري1 در این شرایط غنی شدهاند. همچنین در میان ژنهاي هاب شناسایی شده در اندامهاي رویشی و زایشی تنظیم فرایندهاي زیستی مانند تنظیم بیان ژن، فرایند رونویسی و تنظیم این فرایند در رتبه اول و انتقال پیام مانند مسیر سیگنالینگ اتیلن در رتبه دوم قرار دارد.
نتایج آنالیز پروموتر ژنهاي هاب دخیل در تحمل به تنش خشکی داراي بیان افتراقی -2/5≤ و 2/5≥ با استفاده از ابزار تحت وب Genevestigator، در اندام هاي رویشی و زایشی نشان داد که شایعترین جایگاه عوامل رونویسی به ترتیب MYB، NAC، bHLH، LIC، Zinc finger، Bzip، BCP، TCP،CCT و Heterotrimeric ، AP2 ، دمین B3 ، WRKY ،BZR ،TALE، دمین PHD، هستند که حداقل در 85 درصد از پروموترها داراي جایگاه اتصال هستند و P-Value اتصال آنها نیز کوچکتر از 0/05میباشد - جدول . - 1
