بخشی از مقاله
چکیده
باکتریهاي پکتولیتیک از جمله عوامل مهم پوسیدگی در روي طیف وسیعی از گیاهان زراعی داراي اندام هاي ذخیره اي همچون پیاز می باشند. به منظور شناسایی دقیق عامل بیماري براي اعمال روشهاي کنترل موثر، نمونه برداري از غده هاي آلوده پیازکاریهاي خراسان شمالی انجام پذیرفت. بر مبناي مجموع خصوصیات موفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی جدایه هاي بررسی حاضر Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum شناسایی شدند.
تمامی جدایه هاي شناسایی شده توانایی لهیدگی روي غده ها ي پیاز در شرایط آزمایشگاه را داشتند. از مجموع سه جفت آغازگر به کار برده شده، در تمام جدایه هاي مورد بررسی قطعه 550 بازي با استفاده از جفت آغازگر ExpccF/ExpccR تکثیر شد. درحالیکه هیچ باندي در واکنش زنجیره اي پلیمراز با استفاده از سایر آغازگرها مشاهده نشد. در این بررسی P. carotovorum subsp. carotovorum به عنوان عامل پوسیدگی نرم غده هاي پیاز مزارع استان خراسان شمالی معرفی و صحت این یافته با روش واکنش زنجیره اي پلیمراز اختصاصی تایید شده است.
مقدمه
گونه ها و زیرگونه هاي پکتوباکتریوم متعلق به خانواده اینتروباکتریاسه از جمله بیمارگرهاي مهم باکتریایی محسوب می شوند که بر روي طیف وسیعی از گیاهان به ویژه گیاهان زراعی و زینتی داراي اندام هاي ذخیره اي آبدار و گوشتی، بیماري ایجاد می کنند. علائم پوسیدگی نرم باکتریایی در پیاز شامل لهیدگی آبکی در تعدادي از فلس هاي پیاز است که با توسعه بیماري ممکن است کل غده را دربرگیرد. از غده هاي آلوده بوي ناخوشایندي به مشام می رسد که به علت ترشح تعداد زیادي آنزیم هاي پکتولیتیک از قبیل پکتات لیاز، پکتین لیاز، پلی گالاکتروناز و پکتین متیل استراز ها - 1 - می باشد.
در مزرعه، برگ هاي بخش هوایی پیازهاي آلوده رنگ پریده، سفید و پژمرده می باشند. این بیماري در شرایط گرم و مرطوب خسارت قابل ملاحظه اي به بوته ها پیاز در مزرعه و غده هاي انبار شده وارد می سازد. عامل این بیماري از پیازکاري هاي فارس براساس روشهاي فنوتیپی گزارش شده است . - 8 - در شمال شرقی اسپانیا پس از بروز طوفان و بارندگی، پوسیدگی نرم در پیاز کاریها گسترش زیادي پیدا نمود
در بین روش هاي مختلف شناسایی باکتري هاي پکتولیتیک، واکنش زنجیره اي پلیمراز با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی روشی ساده، سریع، حساس و اختصاصی بوده وبه دلیل هزینه کم، جهت شناسایی پکتوباکتریومها به طور وسیع قابل استفاده میباشد . - 2 - بعضی از آغازگرها بر پایه نواحی حفاظت شده ژنهاي پکتات لیاز که در بیماریزایی پکتوباکتریوم ها نقش دارند، طراحی شده است. جفت آغازگر Y1/Y2 تمام زیر گونه هاي Pectobacterium carotovorum و P. atrosepticum را شناسایی می کند
به منظور شناسایی و ردیابی P. atrosepticum در غدههاي سیب زمینی، می توان از جفت آغازگرهاي اختصاصی - 3 - Eca1f/Eca2r ، - 4 - Y45/Y46 و - 7 - PEAF/PEAR که به ترتیب بر اساس توالی نوکلئوتیدي کاوشگر اختصاصی Pa ، ژن پکتات لیاز Pa و خانواده ژنی Rhs از جدایه تعیین توالی شده P. atrosepticum SCRI1043 طراحی گردیدند، استفاده نمود.
همچنین کانگ و همکاران - 5 - ، بر اساس توالی نوکلئوتیدي URP-PCR حاصل از باکتري P. c. subsp. carotovorum، در ابتدا کاوشگر وسپس جفت آغازگر ExpccF/ExpccR را جهت شناسایی Pcc طراحی نمودند. این مطالعه با هدف بررسی مولکولی جدایه هاي پکتولیتیک عامل پوسیدگی نرم غده هاي پیاز خراسان شمالی انجام شد.
مواد و روشها
سوسپانسیون بافت هاي آلوده داراي علائم پوسیدگی نرم غده هاي پیاز مزارع استان خراسان شمالی روي محیط آگار غذایی مخطط شد. تک پرگنه هاي گرد و کرم رنگ پس از خالص سازي مجدد، روي محیط King’B به منظور چک فعالیت فلورسانت لکه گذاري شدند. فعالیت پکتولیتیکی جدایه ها روي برش هاي سیب زمینی - 9 - و محیط King B حاوي پلی گالاکترونیک اسید - PGA - انجام گرفت. آزمونهاي مرفولوژیکی و فیزیولوژیکی طبق روشهاي متعارف باکتري شناسی انجام شد . - 9 - آزمون بیوشیمیایی استفاده از منابع کربنی مختلف با استفاده از میکروپلیت هاي - Hayward, CA94545, GN2 USA - نیز انجام پذیرفت.
بیماریزایی جدایه ها
سوسپانسیون 107 cfu/ml باکتري در عمق یک سانتی متري غده ها مایه زنی شد. براي هر جدایه پنج تکرار در نظر گرفته شد. میزان لهیدگی بافت بعد از 2-3 روز بررسی شد.
جداسازي DNA
جدایه ها در محیط نوترینت آگار - NA - کشت داده شدند. پس از دو روز رشد در دماي 25-28 درجه سانتیگراد ، سلول ها در آب مقطر به صورت سوسپانسیون در آمدند. چگالی نوري سوسپانسیون ها در 600 نانومتر در 1 واحد تنظیم شد. به هر کدام از لوله هاي اپندورف 0/1 حجم هیدروکسید پتاسیم %5 اضافه شد. نمونه ها سپس به مدت دو دقیقه جوشانده شدند. بعد از سانتریفوز به مدت 5 دقیقه در 8000 دور در دقیقه ، از مایع رویی به عنوان DNA ي الگو در واکنش هاي زنجیره اي پلیمراز استفاده شد.
واکنش زنجیره اي پلیمراز
شناسایی جدایهها ي پکتوباکتریوم بر اساس PCR با آغازگرهاي اختصاصی Y1/Y2 ،Eca1f/Eca2r ، ExpccF/ExpccR انجام گرفت. مخلوط واکنش PCR با حجم 25 میکرولیتر شامل 1X PCR Buffer، 2 میلی مولار MgCl2 ، 200 میکرومول از هر نوکلئوتید، 10 پیکو مول از هر یک از آغازگرها، یک میکرولیتر DNA ي الگو و یک واحد آنزیم تک پلیمراز - شرکت سیناژن - تهیه شد. بعد از اتمام واکنش ، محصولات PCR در ژل آگاروز %1/5 بارگذاري شدند. الکتروفورز در جریان ثابت 80 ولت و در بافر TAE 1X - 40mM Tris, 40 mM NaAc, 2mM EDTA, pH 8 - انجام گرفت.
نتایج و بحث
تمامی جدایه هاي مورد مطالعه، میله اي شکل، بی هوازي اختیاري ، داراي تاژکهاي محیطی، قادر به لهانیدن برشهاي سیب زمینی و ایجاد هاله شفاف در محیط KB حاوي پلی گالاکترونیک اسید و تولید کاتالاز بودند. بر مبناي مجموع خصوصیات باکتري شناسی، جدایه هاي بررسی حاضر P.carotovorum شناسایی شد. کلیه پیاز هاي مورد آزمون پس از 48 ساعت از مایه زنی به صورت طولی برش داده شد و مورد بررسی قرار گرفتند. در تمامی جدایه هاي خالص سازي شده، پوسیدگی مشهود بود.
براي شاهد مثبت از جدایه تیپ ATCC 15 713 و براي شاهد منفی از آب مقطر استریل استفاده شد. از مجموع سه جفت آغازگر به کار برده شده در تمام جدایه هاي مورد بررسی قطعه 550 بازي با استفاده از جفت آغازگر ExpccF/ExpccR تکثیر شد. درحالیکه هیچ باندي در واکنش زنجیره اي پلیمراز با استفاده از سایر آغازگرها مشاهده نشد. در این بررسی P. carotovorum subsp. carotovorum به عنوان عامل پوسیدگی نرم غده هاي پیاز مزارع استان خراسان شمالی معرفی شد و صحت این یافته با روش واکنش زنجیره اي پلیمراز اختصاصی تایید شده است.
