بخشی از مقاله
چکیده
تنش خشکی یکی از عوامل محدود کننده رشد و تولید محصول در گیاهان است و به همین دلیل شناخت ژنهاي مسئول تنش خشکی در گیاهان ضروري است. در این مطالعه به منظور شناسایی ژنهاي مسئول تنش خشکی در بادام وحشی گونه Prunus scoparia از روش cDNA-AFLP استفاده شد.
از بین قطعات حاصل از تکثیر cDNA-AFLP بر روي ژل اکریلآمید 20 قطعه بین شرایط کنترل و تنش بروز متفاوتی را نشان دادند. این قطعات از ژل جدا و توالییابی گردیدند. آنالیزهاي انجام شده بر روي توالیها در سایت NCBI درصد بالایی از شباهت، بین این توالیها با ژنهایی از قبیل Zeaxanthin epoxidase - ZEAEPOX - ،protein kinase MK5 و Protein phosphataseکه قبلاًدر گیاهانی مثل آرابیدوپسیس، زردآلو، سپیدار، ذرت، برنج، سویا، سورگوم و چند گونه گیاهی دیگر در ارتباط با تنش خشکی شناسایی شدهاند را نشان داد.
مقدمه
بادام با نام علمی Prunus dulcis متعلق به خانواده Rosaceae و زیرخانواده Pronoideae گیاهی دیپلوئید و 16 کروموزومی است. این گاهی عموماً خودناسازگار و از نظر خلوص ژنتیکی ناخالص میباشد. از طرفی یکی از مهمترین محصولات آجیلی جهان بوده و تولید میوه آن ارزش اقتصادي بالایی دارد
بادام یکی از قدیمیترین درختانی است که در کشور ایران، قریب 19گونه آن شناخته شده است و غالباً در نواحی نیمهخشک و استپی میروید. درخت بادام به عنوان یکی از مقاومترین درختان به خشکی و گرما در میان میوهجات مناطق معتدله شناخته میشود. با توجه به این که کشور ایران یکی از کشورهایی است که داراي آب و هواي خشک بوده و کمبود آب در کشاورزي و باغبانی از مسائل بسیار مهم میباشد، توسعه کشت و کار ارقام بادام مقاوم به خشکی ضروري است
در این مطالعه سعی شده تا با شناخت ژنهاي مرتبط با تنش خشکی در بادام وحشی گونه Prunus scoparia با استفاده از تکنیک cDNA-AFLP، زمینهاي جهت بهبود تحمل به خشکی و توسعه کشت و کار بادام در ایران فراهم شود. دامنه انتشار بادام وحشی گونه Prunus scoparia وسیع است و در نواحی استپی و ارتفاعات نیمخشک کشور دیده میشود. نام محلی آن در نقاط مختلف بارشین، بادامک، بادامچه و بادامشک میباشد. ارتفاع این درخت به 6 متر میرسد، شاخههایش صاف و براق و قطر گلهایش بالغ بر 25 میلیمتر است
یکی از روشهاي مهم براي بررسی واکنش گیاهان به تنشهاي محیطی بررسی سطوح بیان ژنها میباشد. بهطور معمول روشهاي زیادي براي بررسی بیان ژنها وجود دارد. از بین این روشها، روش cDNA-AFLP بهطور گستردهاي براي بررسی تغییرات بیان ژنها در زمان بروز تنشهاي محیطی استفاده میشود زیرا روشی ساده، داراي بازده بالا و به اطلاعات قبلی از ژنوم گونه مورد مطالعه نیازي ندارد 11 - ، 5، 6و . - 8 به عنوان مثال کامپالانس و همکاران - 2000 - در بادام و سی و همکاران - 2009 - در هندوانه به منظور شناسایی ژنهاي مسئول تنش خشکی از روش cDNA-AFLP استفاده کردند.
روش cDNA-AFLP شامل 4 مرحله میباشد: سنتز cDNA با استفاده از الیگونوکلئوتیدهاي poly-dT، هضم cDNA مورد مطالعه با دو آنزیم محدود کننده و اتصال لنگرهایی به عنوان آداپتور به انتهاي قطعات حاصل، تکثیر پیش انتخابی توسط پرایمرهاي متناظر با لنگرها، تکثیر انتخابی قطعات محدود شده بهوسیله گسترش پرایمرها و در نهایت رونوشتهاي بهدست آمده بر روي ژل اکریلآمید توسط نیترات نقره رنگآمیزي میگردند
با توجه به اینکه در اکثر مطالعات انجام شده، استفاده از تکنیک cDNA-AFLP براي بررسی ژنهاي مرتبط با تنش خشکی بسیار مناسب میباشد 3 - ، 10، 6 و - 8، لذا در این بررسی به منظور مطالعه ژنهاي مرتبط با تنش خشکی در بادام وحشی گونه Prunus scoparia از آن استفاده شد. شناسایی و تشخیص این ژنها در آینده زمینه مناسبی را براي تولید ارقام اصلاح شده مقاوم به خشکی فراهم خواهد ساخت.
مواد و روشها
گلدانهاي حاوي درختچههاي بادام وحشی گونه Prunus scoparia تهیه و تیمار تنش خشکی بر روي آنها اعمال گردید. به نحوي که پس از تهیه نمونههاي شاهد، گلدانها به مدت 7 روز آبیاري نشدند. در زمان مناسب از برگهاي گیاهچههاي هر گلدان نمونهبرداري و در دماي -80 درجه سانتیگراد نگهداري شد.
RNA ژنومی توسط روش ديواریس و همکاران - 1993 - استخراج گردید. براي این منظور در حدود 2 گرم برگ تازه روئیده در ازت مایع به پودر نرمی تبدیل شد و سپس در بافر استخراج - - 0.1M LiCl, 0.1 M Tris-HCl, 1% SDS, 10mM EDTA قرار داده شد. در نهایت RNA استخراج شده توسط روش اسپکتروفتومتري و ژل آگارز مورد ارزیابی کمی و کیفی قرار گرفت.
سنتز cDNA بر اساس دستورالعمل کیت RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis شرکت فرمنتاز صورت گرفت. cDNAهاي سنتز شده پس از دو رشتهاي شدن با استفاده از تکنیک cDNA-AFLP مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. فراوردههاي حاصل از تکثیر cDNA-AFLP در ژل اکریل آمید مشاهده و قطعات مورد نظر که در حالت تنش و بدون تنش تفاوت نشان دادند از داخل ژل جدا گردیدند.
قطعات مربوطه با استفاده از کیت QIAquick® شرکت کیاژن خالصسازي و توسط واکنش PCR با استفاده از آغازگرهاي مرحله انتخابی تکثیر شدند. فراوردههاي حاصل از واکنش PCR توسط کیت خالصسازي فراوردههاي PCR خالصسازي و به ناقل TA cloning شرکت فرمنتاز بر اساس دستور العمل کیت وارد و نهایتاًبه داخل باکتري JM107 کلون گردید.
کلونهاي حاوي پلاسمید نوترکیب از طریق انتخاب رنگ پس از رشد بر روي محیط کشت LB حاوي X-gal شناسائی شدند. در نهایت به منظور تأیید کلونهاي نوترکیب از روش PCR clony استفاده شد. براي این منظور مقدار کمی از هر کلون در واکنش با PCR با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی ناقل تکثیر و کلونهاي نوترکیب حاوي قطعه مود نظر انتخاب گردید.
کلونهاي نوترکیب پس از تأیید در 10 ml محیط کشت جداگانه رشد داده شدند و استخراج پلاسمید در سطح کم با استفاده از کیت خالصسازي پلاسمید شرکت فرمنتاز صورت گرفت. پلاسمیدهاي استخراج شده مجدداً با استفاده از PCR و هضم مورد بررسی قرار گرفته و حدود 100 نانوگرم از پلاسمید نوترکیب استخراج شده جهت توالییابی به شرکت ماکروژن کره ارسال گردید. توالیهاي نوکلئوتیدي حاصل به کمک BLAST در سایت NCBI مورد مقایسه و شناسائی قرار گرفت.
نتایج و بحث
قطعات حاصل از تکثیر cDNA-AFLP بر روي ژل اکریلآمید که در شرایط کنترل و تنش بروز متفاوتی را نشان دادند در شکل 1 نشان داده شده است. تعداد 20 قطعه از این قطعات از ژل جدا و پس از توالییابی در سایت NCBI مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
