بخشی از مقاله
چکیده فارسی
در این پژوهش60 جدایه Fusarium graminearum از کلکسیون موسسه تحقیقات گیاه پزشکی کشور مورد استفاده قرار گرفتند. این جدایه ها قبلا به روش مورفولوژي تشخیص داده شده بودند در این تحقیق به روش مولکولی و با استفاده از آغازگر اختصاصی گونهFg16R / Fg16F همه جدایه ها مورد آزمایش قرار گرفتندبه کمک این آغازگر در همه یک باند 400 جفت بازي تکثیر شد و همه به روش مولکولی نیز به عنوان F. graminearum تشخیص داده شدند. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی ناحیه IGS از DNA ریبوزومی جدایه ها به کمک آغازگر CNL12/CNS1 تکثیر گردید.
اندازه قطعه تکثیر شده 2500 جفت باز بود این قطعه به کمک نشانگر RFLP و با استفاده از پنج آنزیم برشی هضم گردیده ومحصول هضم آنزیمی الکتروفوز گردید. آنالیز IGS-RFLP بر اساس تجزیه خوشه اي و با استفاده از ضریب تشابه و روش UPGMA شش گروه مختلف RFLP در سطح تشابه 84/7 درصد بدست آمد. بیشترین تنوع مربوط به جدایه هاي استان هرمزگان بود و جدایه هاي استان فارس از نطر تنوع ژنتیکی تشابه بیشتري نسبت به سایر استانها داشتند.
نتایج حاصل نشان داد جدایه هاي هر منطقه جغرافیایی از نظر تنوع ژنتیکی به جز در موارد استثنا داراي همبستگی هستند. به عنوان نتیجه گیري می توان گفت که نشانگر IGS-RFLP می تواند به عنوان یک روش مناسب و سریع به منظور بررسی تنوع در جدایه هاي فوزاریوم و تخمین ارتباط ژنتیکی بین گروه ها مورد استفاده قرار گیرد.
مقدمه
بیماري بلایت فوزاریومی سنبله یکی از بیماریهاي مهم گندم می باشد که همه ساله خسارات کمی و کیفی زیادي به این محصول وارد می کند ونه تنها در ایران بلکه درهمه دنیا به عنوان یک بیماري مهم مطرح بوده وبین 30تا70درصدعملکردگندم را کاهش می دهد 9 - ، 11، . - 14 این بیماري از سالها قبل در ایران وجود داشته و از بیماریهاي مهم گندم در مناطق شمالی ایران از جمله مازندران و گرگان به شمار می رود 1 - ، 5 و . - 6 این بیماري توسط 18گونه فوزاریوم ایجاد می شود - 11 - ولی دربسیاري ازکشورها از جمله ایران F. graminearum، F. avenaceum و F. culmorum به عنوان گونه هاي غالب گزارش شده اند.
در مطالعه گسترده انجام شده در چین تعداد 2450 نمونه از خوشه گندم از 21 استان ویا شهر جمع آوري و 18 گونه فوزاریوم جدا وتشخیص داده شد که در 95 درصد نمونه ها عامل غالب Fusarium graminearum بود . - 13 - گونه هاي فوزاریوم بطور معمول با استفاده ترکیبی ازمشخصات مرفولوژیک اندامهاي رویشی، فرم غیر جنسی وجنسی ودیگر ویژگیهایی که غالباً قراردادي است شناسایی می گردند.
استفاده ازنشانگرهاي مولکولی می تواند تنوع ژنتیکی درون گونه اي جدایه هاي فوزاریوم مناطق مختلف را مشخص کند. RFLP در واقع تنوع طولی ایجاد شده در DNA توسط آنزیم هاي برشی و آشکارسازي آن ها در بین افراد مختلف با یک کاوشگر مشخص می باشد. Carter و همکاران - 2000 - با استفاده از ویژگیهاي مرفولوژیک و مارکر هاي مولکولی جدایه هاي F. graminearum جداشده از ذرت، گندم و برنج را مورد بررسی قرار دادند.
بررسی IGS-RFLP انجام شده بر روي جدایه ها، آنها را در دو گروه A و B قرار داد که جدایه هاي بدست آمده از گندم و برنج در گروه A قرار گرفتند در حالیکه جدایه هاي ذرت بین گروهها توزیع گردیدند. آنها نقش میزبان را به عنوان یک فاکتور در توزیع جدایه ها مهم دانستند . - 3 - این تحقیق به منظور شناسایی مولکولی جدایه هاي ایرانیF. graminearum با استفاده از آغازگر ویژه گونه و بررسی تنوع ژنتیکی جدایه هاي استان هاي مختلف ایران با استفاده از روش PCR-RFLP با هدف تعیین گروه هاي مختلف ژنتیکی انجام گرفت.
مواد و روشها
استخراج DNA ژنومی ازجدایه هاي فوزاریوم
در این پژوهش تعداد 60 جدایه Fusarium graminearum از کلکسیون موسسه تحقیقات گیاه پزشکی ایران مورد استفاده قرار گرفتند. کلیه جدایه ها بعد از کشت مجدد به منظور تهیه توده میسلیوم، در محیط کشت مایع سیب زمینی کشت داده شده و بعد از گرمخانه گذاري توده میسلیوم قارچ تکثیر شده به رنگ سفید تا هلوئی در زیر هود استریل جمع آوري و در دماي -20 درجه سلسیوس نگهداري گردیدند. براي استخراج DNA ابتدا نمونه هاي منجمد شده با استفاده از مقداري نیتروژن مایع پودر گردیدند ودر دماي - 20 درجه سلسیوس نگهداري شدند. استخراج DNA مطابق روش اصلاح شده ریدر و برودا - 12 - انجام شد و DNA بدست آمده در فریزر با دماي -20 درجه سلسیوس نگهداري گردیدند.
تشخیص مولکولی جدایه هاي مورد بررسی با استفاده از PCR
براي شناسایی مولکولی جدایه هاي Fusarium graminearum از آغاز گرهاي ویژه گونه Fg16F/Fg16R استفاده گردید - جدول . - 1 واکنش PCR در حجم 20 میکرولیتر با استفاده از کیت AccuPowerTM PCR Premix - Bioneer - و دستگاه ترمال سایکلر - Techne, England - انجام شد. هر آزمایش شامل یک کنترل مثبت و یک کنترل منفی - یک واکنش PCR با DNA ژنومی قارچ - F.oxysporum بود.
محصول PCR روي ژل آگاروز 1/2 درصد الکتروفورز شد. تکثیر ناحیه IGS از DNA ریبوزومی - Intergenic Spacer Region - جهت تکثیر این ناحیه از DNA ریبوزومی از آغازگرهاي CNL12 و CNS1 استفاده شد - جدول . - 1 براي انجام PCR طی آزمایش هاي متعدد، غلظت مواد شیمیایی و چرخه هاي حرارتی مورد نیاز به دست آمد و بهینه گردید.
برنامه حرارتی این پروتکل بهینه سازي گردیده و شامل یک مرحله پنج دقیقه اي در 94 درجه سانتیگراد براي آغاز PCR، 30 چرخه 94 - درجه به مدت 1 دقیقه، 54 درجه به مدت 1 دقیقه و 72 درجه به مدت 2 دقیقه - و درپایان یک مرحله گسترش نهایی در 72 درجه سانتیگراد براي پنج دقیقه بود. نتایج بدست آمده با استفاده از آزمون دقیق فیشر و رگرسیون لجیستیک به کمک نرم افزار SPSS مورد تجزیه و تحلیل آماري قرار گرفتند
نتایج و بحث
تایید جدایه ها با استفاده از آغاز گرهاي اختصاصی گونه F. graminearum به روش PCR در این بررسی تعداد 60 جدایه تشخیص داده شده بر اساس ویژگیهاي مرفولوژیک و پاره اي ویژگیهاي فیزیولوژیک با روش PCR مورد بررسی قرار گرفتند. 100 درصد جدایه ها واجد قطعه 400 جفت بازي بودند وبه عنوان Fusarium graminearum مورد تایید قرار گرفتند - تصویر. - 1 نتایج بدست آمده با مطالعه نیکولسون و همکاران - 1998 - مطابقت داشت . - 10 - براساس گزارشهاي موجود گونه F. graminearum بیش از 80 درصد گونه هاي جدا شده را تشکیل می دهد.
علاوه بر بیماریزایی در گیاه و کاهش محصول، آلودگی با F. graminearum می تواند منجر به آلودگی دانه به فوزاریوتوکسینها از جمله nivalenol - NIV - ، deoxynivalenol - DON - ، مشتقات استیله آنها شامل 3-AcDON، 15-AcDON و 3-AcNIV و zearalenon شوند که در سراسر دنیا شناسایی و مشخص شده اند 2 - ، 4، . - 7 آلودگی دانه به این توکسین ها می تواند خطري جدي براي انسان و یا حیوانات اهلی باشد که از گندم در جیره غذایی آن استفاده می شود.
بررسی ارتباط بین تنوع ژنتیکی جدایه هاي F. graminearum و مناطق جغرافیایی با استفاده از نشانگر IGS- RFLP ناحیه IGS از DNA ریبوزومی با استفاده از آغازگرهاي CNL12 و CNS1 در واکنش زنجیره اي پلی مراز براي 60 جدایه تکثیر گردید. اندازه این قطعه در حدود 2500 جفت بازبود - تصویر. - 2 سپس میزان تنوع ژنتیکی در میان جدایه هاي مورد نظر با استفاده از بررسی چند شکلی طولی قطعات برش یافته ناحیه IGS از DNA ریبوزومی با پنج آنزیم برشی EcoRI، HinfI، HeaIII، HpaII و HhaI در روش RFLP مورد بررسی قرار گرفت. تعداد کل قطعه هاي حاصل از هضم آنزیمی توسط این آنزیم ها 36 قطعه بود.
تمام آنزیم هاي مورد مطالعه قطعه هاي داراي چندشکلی را از ناحیه IGS از DNA ریبوزومی جدایه هاي F. graminearum تولید نمودند. تعداد قطعه هاي داراي چندشکلی 20 عدد یا 57/26 درصد از کل قطعه ها بود. بیشترین تعداد قطعه داراي چندشکلی مربوط به آنزیم HinfI و HpaII با پنج قطعه یا 50 درصد کل قطعه ها بود. دندروگرام تشابه 60 جدایه قارچ Fusarium graminearum با استفاده از نشانگر IGS-RFLP با لستفاده از پنج آنزیم، با برنامه UPGMA و سطح تشابه 84/7 درصد جدایه هاي مناطق مختلف نشان داد که در سطح تشابه 84/7 درصد شش گروه RFLP وجود دارد.
گروه هاي اول تا ششم به ترتیب داراي 45، 6/6، 1/6، 35، 3/3 و 8/3 درصد از جدایه ها را شامل می شدند. بر اساس نتایج هضم آنزیمی ناحیه IGS از DNA ریبوزومی در سطح تشابه 84/7 درصد در بین جمعیت بیمارگر شش گروه RFLP وجود داشت. در تحقیق حاضر گروه بندي جدایه هاي بیمارگر بر اساس IGS-RFLP نشان داد در گروه اول جدایه هاي استان گلستان و خراسان وجود دارد. این نتیجه نشان می دهد این جدایه ها از نظر ژنتیکی بسیار مشابه می باشند. در چنین مواردي مکان جداسازي جدایه هاي مربوط به این مناطق بدلیل مجاورت این دو استان، نزدیک بوده است.
پراکنش بعضی از جدایه ها در گروه هاي RFLP نیز مشاهده می شود. در گروه دوم جدایه هاي استان فارس و کرمان قرار دارند. با توجه به قرار گرفتن جدایه هاي استان هرمزگان در گروه هاي مختلف به نظر می آید جدایه هاي استان هرمزگان از بیشترین میزان تنوع برخوردار باشند. جدایه هاي گروه ششم در هر دو زیر گروه اول و دوم مربوط به جدایه هاي استان فارس می باشد.
به نظر می رسد جدایه هاي این استان از نظر ژنتیکی تشابه بیشتري نسبت به سایر استان ها داشته باشند. تجزیه و تحلیل آماري با استفاده از آزمون دقیق فیشر در جداول توافقی مربوط به نتایج بدست آمده نشان داد که بین جدایه هاي مناطق مختلف جغرافیایی و گروه هاي مختلف ژنتیکی بدست آمده از آنالیز IGS-RFLP همبستگی وجود دارد.
