بخشی از مقاله
چکیده
یکی از مهمترین عوامل موثر در تولید کمپوست، میکروارگانیسمهاي دخیل در تجزیه مواد زائد موجود در ضایعات کشاورزي و صنعتی میباشند، لذا شناسایی این میکروارگانیسمهاي مفید میتواند نقش قابل توجهی در بهبود و غنی سازي کمپوست حاصل ایفا نماید. درتحقیق حاضر، میکروارگانیسمهاي بومی از پسابها و ضایعات متفاوت از قبیل پساب کارخانجات کاغذ سازي، کشتارگاهها، روغن سازي و نیز کمپوست رسیده با استفاده از روش تهیه سري رقت جداسازي و خالص سازي شدند.
فعالیت آنزیمی جدایههاي به دست آمده با استفاده از پلیتهاي حاوي سوبستراي آنزیمهاي هدف - سلولز، زایلن، نشاسته، پروتئین و چربی - مورد بررسی قرار گرفت. نتایج به دست آمده بازگو کننده وجود فعالیت آنزیمی متنوع - سلولاز، زایلاناز، آمیلاز، پروتئاز و لیپاز - در میان سویههاي میکروبی بود.
علاوه بر این، در بخش مطالعات مولکولی و جهت شناسایی جدایهها، واکنش زنجیرهاي پلیمراز با استفاده از آغازگر PAF و PAR جهت تکثیر قطعه 1500bp براي ژن 16SrDNA باکتريها و آغازگر M13F و M13R جهت تکثیر قطعه 1200bp براي ژن 18SrDNA قارچها انجام گردید. پس از توالییابی قطعات تکثیري، به منظور شناسایی گونهها از نرم افزارهاي Chromas، Bioedit، DNAstar و Blast استفاده شد.
نتایج بررسیهاي مولکولی حاکی از وجود سویههاي قارچی Aspergillus fumigatus و سویههاي باکتریایی Thermoactinomyces intermedius، Geobacillus thermodenitrificans، Geobacillus sp.، Bacillus licheniformis، Brevibacillus parabrevis، Brevibacillus formosus، Brevibacillus agri، Bordetella petrii، Aneurinibacillus migulanus، Pseudoxanthomonas sp. بود.
استفاده از جدایههاي حاصل به صورت یک مخلوط میکروبی با توجه به دارا بودن انواع آنزیمهاي لازم جهت تجزیه مواد آلی و تولید کمپوست با کیفیت عالی و در مدت زمان کوتاه میتواند گامی موثر در صنعت بازیافت کشور محسوب گردد.
مقدمه
در دنیاي امروز، توجه زیادي به فرآیند کمپوستینگ مبذول شده که این امر ناشی از اهمیت این پدیده به عنوان یکی از مهمترین فرایندهاي تبدیل کننده مواد زائد به یک محصول ارگانیک و ثابت میباشد. علاوه بر این، مواد آلی تولید شده به طور مستقیم براي گیاه مورد استفاده بوده و میتوانند به میزان زیادي خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاك را بهبود ببخشد
کمپوستینگ از سه مرحله مختلف تشکیل شده است: در مرحله اولیه فعالیت و رشد میکروارگانیسمهاي مزوفیلیک را داریم که منجر به افزایش دما و تجزیه مواد سادهتر میشود. در مرحله بعدي میکروارگانیسمهاي ترموفیلیک غلبه مییابند و از رشد و فعالیت میکروارگانیسمهاي غیرترموفیل ممانعت به عمل میآورند. در مرحله پایانی که دوره رسیدگی و بلوغ نیز نامیده میشود،میکروارگانیسمهاي مزوفیلیک جدیدي مجدداً شروع به رشد مینمایند.
فرایند کمپوستینگ یک فرایند بیولوژیکی بوده و در فرایندهاي بیولوژیک، میکروارگانیسمها کلیديترین نقش را در پیشبرد و سرعت بخشیدن به فرایند بر عهده دارند و لذا هرچه میکروارگانیسمهاي موجود از قدرت تجزیه کنندگی بالاتري برخوردار باشند، مدت زمان فرایند کوتاهتر میگردد که از لحاظ اقتصادي اهمیت زیادي دارد - . - 7 از سالها پیش تحقیقات گستردهاي در جهان در جهت جداسازي و شناسایی این میکروبها انجام شده است و براي این منظور از تکنیکهاي مختلف و متنوعی استفاده گشته است که از این بین میتوان به استفاده از روشهاي محیطهاي کشت اختصاصی و انتخابگر، خصوصیات بیوشیمایی و مورفولوژیک مثل قدرت تجزیه فسفولیپید اسیدهاي چرب و یا تجزیه ترکیبات سلولزي و ... اشاره نمود
بررسیها نشان داده که در روش کشت میکروبی تنها بخشی از تنوع میکروبی در آنالیزها وارد میشود و بخش اعظمی از جامعه میکروبی از دست میرود و به تبع آن نیز نتایج حاصله نمیتواند آیینه تمام نمایی از آنچه در محیط مورد بررسی رخ میدهد، به حساب آید
با توجه به محدودیتها و مشکلات متعدد این تکنیکها از قبیل سختی و زمانبر بودن آنها، محققین همواره بدنبال روشهاي جدیدي براي این کار بودهاند. از دهه 90 به بعد با گسترش روشهاي مولکولی بر پایه توالیهاي DNA، راهکارهاي جدیدي براي شناسایی عوامل میکروبی موثر در فرایند کمپوستینگ به وجود آمدند که از آنها میتوان به مارکرهاي مولکولی مختلف مثل RAPD، ARDRA، SSCP، T-RFLP، ITS، 18SrDNAو 16SrDNA اشاره نمود.
در این تحقیق سعی شد تا میکروارگانیسمهاي موثر که توانایی تجزیه مواد سلولزي، لیگنوسلولزي، پروتئینی، چربی و مواد نشاستهاي را دارا هستند، جداسازي و شناسایی شوند تا با استفاده از آنها به صورت یک مخلوط میکروبی در فرآیند کمپوستینگ علاوه بر کاهش مدت زمان فرآیند کمپوستینگ، کیفیت محصول نهایی را افزایش یابد.
مواد و روشها غنی سازي، جداسازي و خالص سازي میکروارگانیسمها
در این مطالعه براي جداسازي میکروارگانیسمهاي تجزیه کننده سلولز، نشاسته، پروتئین، زایلن و چربی از کمپوست تولیدي کارخانه بازیافت اصفهان و همچنین از لجن فعال استخر هوادهی تصفیه خانه اصفهان، پساب کارخانههاي کاغذسازي، روغنسازي و کشتارگاه اصفهان استفاده شد، سپس این جدایهها در بانک ژن پژوهشکده بیوتکنولوژي جهت نگهداري طولانی مدت و ادامه مطالعات ذخیره گردیدند.
استخراج DNA ژنومی از باکتري و قارچها
DNA باکتريهاي گرم منفی با استفاده از کیت اسخراج DNA ژنومی شرکت BioNeer و DNA باکتريهاي گرم مثبت و قارچها با استفاده از روش CTAB، استخراج شدند. جهت بررسی کمیت و کیفیت نمونههاي استخراج شده DNA، براي اینکه مشخص شود DNA سالم بوده و شکستگی ندارد، مقدار بسیار کمی از آن بر روي ژل آگارز %1 الکتروفورز مورد آزمایش قرار گرفت. در نهایت DNA هایی که باندي پررنگ در بالاي ژل آگارز ایجاد نمودند جهت انجام آزمایشات انتخاب شدند. از دستگاه نانودراپ و ژل آگارز 1 درصد جهت بررسی کمیت و کیفیت DNA استفاده شد.
واکنش زنجیرهاي پلیمراز با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی ژن 16SrDNA و 18SrDNA
واکنش زنجیرهاي پلیمراز با استفاده از آغازگرPAF و PAR براي باکتريهاو آغازگر M13F و M13R براي قارچها با استفاده از دستگاه ترموسایکلر Bio-Rad انجام شد. براي هر دو نوع میکروارگانیسم - باکتري و قارچ - ، مخلوط واکنش حاوي 2/5 میکرولیتر PCR buffer - 10X - ، 0/5 میکرولیتر - 10 mM - dNTP، 2/5 میکرولیتر - 25 mM - MgCl2 ، 0/5 میکرولیتر از هر آغازگربا غلظت 10pmol ،0/2 میکرولیتر آنزیم Taq DNA polymerase - Fermentase - و 0/5 میکرولیتر از DNA ژنومی استخراج شده با غلظت 100ng بوده که این مخلوط با 17/8 میکرولیتر آب دو بار تقطیر به حجم 25 میکرولیتر رسانده شد.
برنامه PCR باکتريها طبق روش استفاده شده زکریا و همکاران با اندکی تغییر - - 8 و قارچها طبق پروتکل سابین و همکاران با اندکی تغییر انجام شد. محصولات حاصل از PCR بر روي ژل آگارز 1 درصد تفکیک و ارزیابی شدند و باند مورد نظر با سایز مارکر -100 bp 3000، SMO323 شرکت فرمنتاز مقایسه شد، قطعه 1500bp تکثیر شده براي ژن 16S و قطعه 1200bp براي ژن 18S در همه سویهها شناسایی گردیدند.
کلون کردن ژن 16SrDNA و 18SrDNA و تجزیه دادهها
جهت بدست آوردن توالی ژنها، پس از بازیافت کردن محصول واکنش زنجیرهاي پلیمراز از روي ژل، محصول خالص شده با استفاده از پلاسمید pTZ57R/T کلون شده و در نهایت به مرکز توالییابی SEQLAB آلمان فرستاده شد. پس از توالییابی قطعات تکثیري، به منظور شناسایی گونهها از نرم افزارهاي استفاده شد.
فعالیت آنزیمی سویههاي میکروبی
فعالیت آنزیم پروتئاز براساس روش ماهانتا و همکاران بررسی شد - - 5، تولید سلولاز طبق پروتکل لی و همکاران، تولید لیپاز براساس روش کوئوکر - - 4 و آزمون تولید آمیلاز نیز بر اساس روش کامون و همکاران انجام پذیرفت - . - 3
نتایج و بحث نتایج شناسایی مولکولی
در این مطالعه سویه مزوفیل Aneurinibacillus migulanus، Brevibacillus parabrevis، Brevibacillus agri، Pseudoxanthomonas sp.، Brevibacillus formosus، Bordetella petrii، Bacillus licheniformis که در دماي بین 30 تا 37 درجه رشد بهینه داشتند و 3 سویه ترموفیل Geobacillus thermodenitrificans، Geobacillus sp.، Thermoactinomyces intermedius که در دماي 65-50 رشد رشد بهینه داشتند مورد شناسایی قرار گرفتند. 3 سویه قارچی مزوفیل که هر سه جنس و گونه مشابه Aspergillus fumigauts ، ولی از نظر فعالیت آنزیمی متفاوت بودند، شناسایی شدند.
بررسیهاي انجام شده پیرامون اثرات تجزیه کنندگی سویه ها
به منظور فوق این سویه در محیط هاي پایه سلولز، چربی، پروتئین، زایلن و نشاسته کشت داده شدند و توانایی تجزیه مواد آلی مذکور بر اساس رشد و یا عدم رشد میکروارگانیسمها در محیط کشت حاوي سوبستراي خاص بررسی و نتایج به دست آمده در جداول زیر گزارش شده است.
