بخشی از مقاله
چکیده:
مقدمه: شیگلا دیسانتري یکی از مهمترین باکتریهاي بیماریزاي روده اي براي انسان است. شیگاتوکسین - سم این باکتري - با ورود به سلول هاي اپیتلیال باعث مهار سنتز پروتئین و مرگ سلولی خواهد شد . علیرغم مطالعات فراوان جهت تولید واکسن علیه آن، هنوز ضرورت تداوم مطالعه در حصول به پروتئین نوترکیب از نوع stxA وجود دارد.
هدفاین مطالعه بررسی و تعیین جایگاههاي مناسب جهش و طراحی ژن سینتتیک زیر واحد stxA و سپس بیان و بهینه سازي آن و در نهایت بررسی روش تخلیص آن جهت مطالعات بعدي ایمنی زایی بوده است.
روش ها: پس از طراحی و تهیه ژن سنتتیک pET28a/stxA موتانت - - R170L -A231D –G234E ، واکنش PCR جهت کنترل صحت حضور این ژن انجام گردید. پس از انتقال این وکتور به سلول میزبان Bl21 DE3 ، بیان، بهینه سازي و نهایتا تخلیص پروتئین حاصل بررسی گردید.
یافته ها: نتیجه مطالعات اولیه منجر به طراحی ژن stxA موتانت گردید. نتایج واکنش PCR با استفاده از پلاسمید سنتتیک نشان از صحت ژن مورد مطالعه داشت. پس از بیان این ژن در سلول میزبانBl21 DE3 ، بهینه سازي آن نیز بررسی گردید. درنتیجه تولید مقادیر زیادي از این پروتئین به شکل اجسام توده اي نشان داده شد. تخلیص انکلوژن بادي و سپس پروتئین هاي مربوطه با استفاده از روش هاي تلفیقی صورت گرفت.
بحث و نتیجه گیري نهایی : با توجه به مکانیسم اثر شیگاتوکسین و طراحی جهش هاي انتخابی با آرایش جدید در این ژن، پیش بینی می شود که این پروتئین بیانی آن داراي اثر سمیت کمتري نسبت به سایر موتانت هاي قبلی داشته باشد، در نتیجه می تواند به عنوان کاندید واکسن برتر مطرح گردد.
مقدمه :
باکتري شیگلا دیسانتري یکی از مهمترین باکتري هاي مهم بیماریزاي روده اي براي انسان می باشد - 1، 2، . - 3 علت اصلی همه گیري اسهال ناشی از شیگلوزیس در یک قرن اخیر این باکتري بوده است.
مهمترین فاکتور بیماریزا در این باکتري اگزوتوکسین stx - با دو زیر واحد Aو - B و با سمیت فوق العاده بالا و کشنده % LD50 = 8.5 µg/Kg - - ، یک مولکول هگزامري با وزن ملکولی در حدود 70 kD است که با اتصال به رسپتورهاي سطحی سلول هاي هدف - - Gb3 باعث اپوپتوزیس و مرگ سلول خواهد شد - 4، 5، .. - 6 این توکسین را باکتري شیگلا دیسانتري نوع 1 تولید مینماید، همچنین توکسینی مشابه با آن با نام stx1 و stx2 توسط E. coli O157 نیز تولید میگردد که مشابهت آنها 98 درصد است
حساسیت سلول هاي اندوتلیال کلیه انسان به stx در مقایسه با stx1 تا 1000 برابر بیشتر است - - 10 و به همین دلیل عامل اصلی ایجاد کننده بیماري خون ادراري Hemolytic - HUS - Uremic Syndrom معرفی گردیده است
سمیت و قدرت ایمنی زایی شیگاتوکسین بسیار بالا است به شکلی که حدود 28 نانو گرم آن باعث مرگ یک موش می گردد و همچنین بدلیل قدرت آنتی ژنی بالا، داراي پتانسیل ایجاد پاسخ ایمنی و تولید آنتی بادي علیه توکسین در بدن میزبان می باشد - 12،5،. - 4 زیر واحدstxB با 69 اسیدآمینه و وزن مولکولی حدود 7/7 کیلو دالتون، به صورت پنتامر به زیر واحد stxA با 294 اسید آمینه با وزن ملکولی در حدود 32 kD متصل است.
شیگا توکسین ابتدا بواسطه زیر واحد B به رسپتور سطحیGb3 مستقر در غشاء سلول اپیتلیال متصل شده و تشکیل یک کمپلکس پوشیده از مولکول کلاترین می دهد و به صورت یک وزیکول طی فرآیند اندوسیتوز، انتقال داخل سلولی انجام می گردد. سپس یک آنزیم سرین پروتئاز به نام Furin در گلژي باعث برش پیوند پپتیدي میان دو بخش - - 28 kD - A1 و - 4 kD - A2 میگردد. متعاقب آن این مجموعه بواسطه رسپتورهاي KDEL موجود در غشاء ER به شبکه آندوپلاسمی وارد و در نتیجه احیاي پیوند دي سولفیدي باقیمانده میان A1 و A2 ، آنها را کاملا از هم جدا میکند.
