بخشی از مقاله
چکیده
شترها نقشی کلیدی در تامین غذا برای مردمی دارند که در بیابانهای سرد و گرم جهان زندگی میکنند. برخلاف شترهای تککوهانه، اندازه جمعیت شترهای دوکوهانه کوچکتر بوده و در برخی کشورها مانند ایران، در خطر انقراض قرار دارند. در مطالعه حاضر ژنوم شتر های دو کوهانه توالی یابی و گردآوری گردید و پراکنش ریزماهواره ها مورد بررسی قرار گرفت. جهت انجام آزمایش توالی یابی کامل ژنوم با استفاده از پلتفرم ایلومینا انچام گردید سپس بعد از تعیین کیفیت و ارزیابی وضعیت توالیها، از برنامه MISA برای شناسایی ریز ماهواره های گسترده ژنوم استفاده شد.
نتایج ارزیابی ها و آنالیزهای منجر به شناسایی 45753 ریزماهواره برای شترهای دوکوهانه گردیدکه تقریباً 3 Mb ژنوم شتر های دو کوهانه را تشکیل می دهد. که نتایج بدست آمده تقریبا مشابه سایر پستانداران می باشند. به توجه به شناسایی موثر نشانگرهای ریزماهوره ای می توان با طراحی استرانژی آمیزشی مناسب باعث کاهش هم خونی و متعاقبا افزایش تنوع زیستی شده و از انقراض احتمالی در آینده بخصوص در مورد گونه های در حال انقراض مانند شتر بهره جست.
.1 مقدمه
شترسانان در حال حاضر متعلق به دو گونه ی قدیمی - خانواده - Camelina یعنی شتر های دو کوهانه Camelus Bactrianus و شتر های تک کوهانه Camelus Dromedarius و چهار گونه جدید - خانواده - Lamini که شامل گواناکو Lama Guanicoe، لاما Lama Glama، آلپاکا Lama Pacos و ویکونا Lama Vicugna هستند. به نظر می رسد شتر دوکوهانه وحشی تنها بازمانده گونه ی وحشی از خانواده شتر های قدیمی است با توجه به یافته های فسیلی شترسانان در آمریکای شمالی در دوره ی Eoceneتقریباً 40-45 میلیون سال پیش تکامل یافته اند
شترهای دو کوهانه حیوانات پر طاقتی هستند که می توانند در مناطق بیابانی و نیمه بیابانی زندگی کنند. این حیوانات می توانند شرایط سخت و خشن مانند خشکی ها، خوراک ضعیف، سرما و گرما را تحمل کنند. شتر ها همچنین برای حمل و نقل، تولید شیر، گوشت، پوست و پشم نگهداری می شوند. طبق یافته ها شتر های دو کوهانه مدلی ایده آل برای شرح سازگاری بیابانی به دلیل توانایی این حیوانات در تحمل شرایط اکولوژیکی بیابانی هستند
ریز ماهواره ها که به عنوان تکرار های توالی ساده - SSR - یا تکرار های کوتاه پشت سر هم - STR - شناخته می شوند مشهورترین نشانگر ها در بررسی های ژنتیک جمعیت به شمار می روند. آنها از موتیف های یک تا شش نوکلئوتیدی تشکیل یافته اند که رفتار های جهشی خاصی دارند
ریزماهواره ها در ابتدا تحت عنوان DNA آشغال - junk DNA - شناخته می شدند یا به طور گسترده به عنوان نشانگر ژنتیکی طبیعی استفاده می شدند [4] در حالی که در مطالعات اخیر مشخص شده که ریزماهواره ها می توانند نقش بسزایی در فعالیت ژن ها، تشکیل کروماتین و فرآیند های متابولیکی DNA ایفا می-کنند
تکرارهای پشت سرهم - STR - در مناطق مصنوعی می توانند تغییرات ساختار ثانویه DNA را با تشکیل حلقه ها و تغییر کروماتین ایجاد کند که به طور غیر مستقیم باعث تغییرات در بیان ژن های نزدیک می شود
بیش از سه درصد از ژنوم انسان از ریزماهواره ها تشکیل یافته است. ریزماهواره ها نسبتاً فراوان، داری غالبیت ناقص - co-daminat - و پراکنش بالا - حاضر در همه جا - هستند و سطوح گسترده پلیمورفیسم را در ژنوم های یوکاریوتی و پروکاریوتی نشان می دهند .[7] ریزماهواره ها در مناطق کدینگ و غیر کدینگ حضور دارند [8] اما در مناطق غیرکدینگ فراوانتر هستند
ریزماهواره ها یکی از پر کاربرد ترین نشانگر های مولکولی در ژنتیک جمعیت هستند که می توانند برای بررسی تنوع زیستی، اثر انگشت، مطالعات جمعیت، نقشه برداری ژنتیکی در میان جمعیت ها و تاریخ تکاملی مورد استفاده قرار گیرند .[10] تغییرات SSR در 5ʼ-UTR ها می تواند بیان ژن را با تأثیر بر رونویسی و ترجمه تنظیم کند، اما گسترش در 3ʼ-UTR ها باعث افت رونویسی و تولید mRNA گسترش یافته می کند، که می تواند اسپلایسینگ را مختل کند و ممکن است دیگر عملکرد های سلولی را مختل کند. SSR های اینترونی میتوانند رونویسی ژن، اسپلایسینگ mRNA یا انتقال به سیتوپلاسم را تحت تاثیر قرار دهند. تمام این اثرات در نهایت می توانند منجر به تغییرات فنوتیپی شوند
ریزماهواره ها همچنین به خاطر نقش داشتن در حدود 40 بیماری عصبی ازجمله بیماری هانتیگون، - FRDA - Ataxia Friedreich، Spoinocelebellar Ataxias - SCA - ، سندروم - FRAXA - Fragile X و دیستروفی ماهیچه ایی نوع 1 و DM1 - 2 و - 2 شناخته شده اند .[12] این مطالعه با هدف توالی یابی کامل ژنوم شترهای دوکوهانه و شناسایی نشانگرهای ریزماهواره ای جهتاستفاده برای ارزشیابی تنوع زیستی در شترهای دوکوهانه انجام گرفت.
.2 مواد و روش
در این مطالعه ژنوم 6 نفر شتر دوکوهانه متعلق به منطقه استان اردبیل توالی یابی گردید. نمونه های خون از رگ جگولار شتر ها گرفته شد و در دمای -20 درجه سانتی گراد تا زمان استفاده نگهداری شدند. استخراج DNA با استفاده از کیت های تجاری GeanAll صورت گرفت. جهت کنترل کمی DNA استخراج شده از دستگاه نانودرآپ استفاده شد که نسبت 260 به 280 برای شتر های دو کوهانه 1/96 اندازه گیری شد. کنترل کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز سنجیده شد. نمونه های DNA با استفاده از سیستم Illumina Hiseq 2000 - Illumina, USA - با روش paired end با اندازه 100 bp توالی یابی شدند که یک کتابخانه با اندازه ورودی 360 bp ایجاد شد.
جهت کنترل کیفیت خوانش های خام در ابتدا نرم افزار FastQC مورد استفاده قرار گرفت. نتایج به دست آمده از این برنامه نشان داد که آلودگی آداپتوری در این توالی ها وجود ندارد. جهت پالایش کیفی خوانش ها بعد از کنترل کیفیت از برنامه [13] Trimmomatic v0.36 با رویکرد MAXINFO استفاده شد. برای پالایش خوانش ها در این برنامه، خوانش ها با طول کمتر از 40باز حذف شدند. بعد از این مرحله مجدداً خوانش ها توسط نرم افزار FastQC مورد ارزیابی کیفیت قرار گرفتند که نتایج به دست آمده از این برنامه نشان داد که کیفیت خوانش ها افزایش یافته است. با استفاده از برنامه CLC Genomics Workbench - CLC Bio, Aarhus, Denmark - گردآوری دنو وو خوانش ها صورت گرفت. پارامتر های استفاده شده در این برنامه عبارتند از : 3 برای هزینه عدم تطابق، 3 برای جریمه حذف و درج، 0,5 برای length fraction و 0,8 برای similarity fraction اعمال شد.
.1-2 شناسایی نشانگرهای ریزماهوارهای ژنوم در شترهای دوکوهانه
از برنامه MISA - MIco SAtelllite identification tool - برای شناسایی ریز ماهواره های گسترده ژنوم استفاده شد. این برنامه قادر به شناسایی ریز ماهواره های کامل و مرکب است. جهت شناسایی تکرار های مونو، دی، تری، تترا، پنتا، هگزا، هپتا و اکتا نوکلئوتید به ترتیب حداقل 12، 6، 5، 5، 4، 4، 3 و 3 در نظر گرفته شد. حداکثر فاصلهایی که بین ریزماهواره های مرکب در نظر گرفته می شود 100 باز است.
.3 بحث و نتیجه گیری
از آنجایی که به طور کلی کیفیت خوانشها در انتهای 3ʼ و 5ʼ تا حدودی کمتر از قسمتهای میانی خوانشها میباشند، بازهای ناخوانا - N - و بازهای با نمره کمتر از 5 از دو انتها ویرایش شدند. بعد از اعمال این نوع پالایش، خوانشهایی که به طول کمتر از 40 باز رسیده بودند نیز حذف گردیدند. بعد از انجام مرحله پالایش، کنترل کیفی مجددی با استفاده از FastQC صورت پذیرفت و افزایش کیفیت در انتهای 3ʼ خوانشها مشاهده شد - شکل . - 1 هر چند به طور کلی دادههای حاضر، پیش از پالایش نیز دارای کیفیت بالایی بودند.
