بخشی از مقاله
چکیده
یکی از مهمترین بیماریهاي قارچ خوراکی لکه قهوه اي باکتریایی می باشد . در این پژوهش به منظور شناخت و بررسی جدایه هاي P. tolaasii ، از روشهاي شناسایی فنوتیپی، ژنتیکی و فیلوژنی استفاده گردید. در سالهاي 88 و89 نمونه هاي قارچ تکمه اي آلوده به بیماري لکه قهوه اي از مراکز کشت و پرورش مناطق مختلف ایران جمع آوري گردید. پس از تهیه سوسپانسیون در آب مقطر استریل و کشت باکتري روي محیط آگار غذایی KB جدایه هاي تولید کننده پیگمان سبز انتخاب گردید. سپس بر اساس آزمون بیماریزایی و بیوشیمیایی شناسایی اولیه انجام گرفت.
از جفت آغازگر اختصاصی - PT1A/PT1D1 - به منظور شناسایی ژنتیکی و پرایمر - P0/P6 - 16srRNA جهت توالی یابی نمونه ها استفاده گردید. نتایج دندروگرام نشان داد که نماینده هاي جدایه هاي P. tolaasii ایران در بلاست با جدایه هاي موجود در بانک ژن - NCBI - شباهت کامل داشته و در یک گروه فیلوژنی قرار گرفته و از Pseudomonas reactans و Pseudomonas syringae کاملا مجزا می باشد. بنا براین جدایه هاي ایرانیP. tolaasii از نظر فیلوژنتیکی با جدایه هاي سایر مناطق شباهت دارد.
مقدمه
قارچهاي خوراکی - Agaricus bisporus - یکی از مهمترین محصولات باغبانی در جهان محسوب می شود. در روند تولید آن عوامل متعددي از جمله آفات و بیماریها خسارتهاي زیادي به آن وارد می کنند . یکی از بیماریهاي مهم قارچ خوراکی، لکه قهوه اي ناشی از باکتري ها - Brown blotch - می باشد که در تمام مناطق عمده کشت قارچ جهان وجود دارد و باعث کاهش بازار پسندي، کوتاه شدن دوره نگهداري محصول و در نهایت لزج و غیر قابل مصرف شدن آن می گردد . - 3 -
باکتریهاي متعددي می توانند عامل این بیماري باشند از جمله باکتري Pseudomonas tolaasii با تولید توکسین لیپودپسی پپتید به نام تولاسین که خسارت جدي به تولید کنندگان وارد می سازد. - - 5 باکتري P. reactans و برخی از سودوموناسهاي فلورسنت نیز با شدت کمتر در این مسئله دخالت دارند. این بیماري علاوه بر قارچهاي خوراکی تکمه اي به قارچهاي صدفی نیز خسارت قابل توجهی وارد می کند.
علائم این بیماري در ابتداي آلودگی به صورت لکه هاي زرد رنگ روي کلاهک و ساقه قارچ ظاهر می شوند و پس از مدتی به قهوه اي شکلاتی تغییر رنگ می دهند که با گذشت زمان این لکه ها به نقاط فرورفته اي تبدیل می شوند که هرچه از زمان آلودگی بگذرد کلاهک و ساقه قارچ لزج، آبدار و بد بو شده و غیر قابل استفاده می گردند. در ایران این بیماري اولین بار از استان مازندران گزارش شد - 8 - و در حال حاضر این بیماري در سالهاي اخیر در مناطق مختلف کشور مشاهده شده است. هدف از این تحقیق شناسایی فنوتیپی، ژنتیکی و فیلوژنی باکتريPseudomonas tolaasii عامل لکه قهوه اي قارچ خوراکی تکمه اي در استانهاي مختلف ایران می باشد.
مواد وروشها
نمونه گیري وجداسازي : نمونه هاي مختلف با علائم لکه قهوه اي در کلاهک و ساقه قارچ دکمه اي از تولید کنندگان مختلف در استانهاي تهران، البرز، مازندران، گیلان، قزوین، کرمانشاه و اردبیل جمع آوري و به آزمایشگاه جهت جداسازي عامل بیماري منتقل گردید . در آزمایشگاه پس از شستشوي سطحی قطعاتی از نمونه ها در زیر آب شیر، سپس در یک میلی لیتر آب مقطر استریل خرد و سوسپانسیون گردید، از هر نمونه یک لوپ روي محیط کشت کینگ ب - KB - مخطط گردید و پس از 48 ساعت نگهداري در دماي 270C کلنی هاي فلورسنت انتخاب و در محیط کشت آگار غذایی - - NA لکه گذاري گردید.
اثبات بیماریزایی هر یک از جدایه ها به روش - - 2 انجام شد. جدایه ها بر اساس خصوصیات فنوتیپی به روش شاد وهمکاران - 9 - از نظر واکنش گرم، اکسیداز، تولید لوان، هیدرولیز ژلاتین، نشاسته، لیپاز، لهانیدن ورقه هاي سیب زمینی، ایجاد فوق حساسیت در توتون - - HR، آرژنین دي هیدرولیز، احیاي نیترات، 2 کیتو گلوکونات، لسیتیناز، تولید H2S از سیستئین، استفاده از سیترات و تولید اسید از قندهاي مانیتول، سوکروز، سوربیتول، فروکتوز، آرابینوز، آرابیتول به همراه جدایه هاي استاندارد P. tolaasii NCPPB 2192 و مورد بررسی و شناسایی قرار گرفتند.
شناسایی اختصاصی : P. tolaasii ابتدا DNA جدایه ها با روش لیز قلیایی استخراج گردید - 7 - ، از پرایمرهاي اختصاصی PT1A - 5`- استفاده شد - - 4 تعیین توالی نوکلئوتیدي - : - Sequencing براي تعیین جایگاه فیلوژنتیکی جدایه هاي قارچ تکمه اي از آغازگر طراحی شده از ناحیه 16srRNA با پرایمرهاي P0 - 5` GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3` - 0و - P6 - 5`- CTACGG CTACCTTGTTACGA-3` انجام شد - . - 6
براي تعیین توالی، محصولات PCR نمونه هاي مورد نظر - - A1,A13 به شرکت ماکروژن - Microgen, Korea - فرستاده شد و تعیین توالی با روش اتوماتیک انجام گرفت. تعیین توالی در هر دو جهت سنس و آنتی سنس و با استفاده از آغازگر هاي مذکور انجام شد. توالی هاي بدست آمده ابتدا با استفاده از نرم افزار Seqman اصلاح شده و سپس با به کارگیري برنامه BLAST - NCBI - ، با توالی هاي دیگر موجود در بانک ژن همردیف گردیدند . - 1 -
نتایج و بحث
از بین 50 جدایه باکتري که از قارچهاي تکمه اي - Agaricus bisporus - با علائم لکه قهوه اي جداسازي شده بود 15 جدایه بر اساس خصوصیات فنوتیپی به P. tolaasii شباهت داشتند. تمامی جدایه ها گرم منفی، فلورسنت و هوازي بودند. استرینها اکسیداز مثبت، آرجینین دهیدرولاز منفی ،لوان منفی و فاقد توانایی لهانیدن ورقه هاي سیب زمینی و واکنش فوق حساسیت در توتون بودند و در استفاده از کربوهیدراتهاي آرابیتول ،آرابینوز،فروکتوزوسوربیتول مثبت وسوکروز وسلوبیوز منفی بودند.
تمامی جدایه ها در تکثیر با آغازگرهاي PT1D1 /PT1A باندي به اندازه 449bp تکثیر گردید که این باند به استرینهاي P. tolaasii اختصاص دارد. باند بدست آمده از این PCR براي 12 جدایه و نیز استرین هاي استاندارد P. tolaasii یکسان بود - شکل. - 1 در تکثیز با آغازگرهاي 16srRNA جدایه ها توالی یابی گردید و نتایج دندروگرام بدست آمده با استفاده از نرم افزار Seqman و همردیف سازي با نمونه هاي بانک ژن - NCBI - وبرنامه BLAST نشان داد که نماینده هاي جدایه هاي ایران در بلاست با جدایه هاي موجود در بانک ژن - NCBI - شباهت کامل داشته ودر یک گروه فیلوژنی قرار گرفته ونسبت به P. reactans موجود در بانک ژن وهمچنین با P. syringae ایرانی کاملا مجزا بودند بنا براین جدایه هاي ایرانیP. tolaasii از نظر فیلوژنتیکی با جدایه هاي سایر مناطق شباهت دارد. - شکل - 2
