بخشی از مقاله
چکیده –
باکتری های Bacillus subtilis و Escherichia coli با استفاده از طیف سنجی فروشکست القایی لیزری - LIBS - آنالیز شدند. طیف حاصل شامل بیست و دو خط طیفی یونی و اتمی بود که اغلب عناصر غیر آلی مانند کلسیم، منیزیم و سدیم درطبقه بندی و شناسایی باکتری های گرم منفی و مثبت مورد استفاده قرار گرفتند. از یک تابع تشخیص برای تفکیک دو باکتری Bacillus subtilis و Escherichia coli استفاده شد. نتایج بررسی ها بیانگر تفکیک بسیار خوبی بین این دو باکتری بود. به طوری که توانایی LIBS را در شناسایی و طبقه بندی باکتری درکاربرد های پزشکی را نشان می دهد.
-1 مقدمه
باکتریها میکروارگانیسم های بسیارکوچکی با ابعاد حدود - 10-6m - یا کوچکتر با اشکال مختلف میباشند - . - 1 دیواره سلولی باکتری نقش مهمی در شناسایی وتفکیک بین آن ها ایفا می کند، معمولا باکتری ها براساس دیواره خارجی به دونوع گرم مثبت و گرم منفی طبقه بندی می شوند. این طبقه بندی براساس یک نوع رنگ آمیزی گرمی است که در سال 1884 توسط هانس کریستین گرم توسعه داده شد. - . - 2 باکتریها دارای ترکیبات پیچیده مولکولی میباشند. درجدول1 ترکیبات مولکولی غشای خارجی باکتری ها نشان داده شده است.
جدول :1 اجزا غشا خارجی باکتری ها
وجود عناصر معدنی مانندMg ،P ، Caو Na در بدن باکتریها و شاید به طور خاص درLPS ، برآورد امکان بررسی و شناسایی باکتری ها به کمک روش های بیناب نگاری را محتمل می سازد. همچنین Ca2+وMg2+ به طور خاص نقش مهمی در تثبیت LPSهای مجاور دارند
طبق آمار، به دلیل وجود انواع باکتری ها در محیط و مواد غذایی سالانه تعداد زیادی از افراد دچاره بیماری شده وحتی جانشان را از دست می دهند. اگر امکان شناسایی سریع ونوع این باکتری ها فراهم شود، می توان از بسیاری مرگ و میر های ناشی از آنها جلوگیری کرد. روش های فعلی شناسایی باکتری ها با وجودی که روشهای دقیقی هستند، درمقایسه با مدت لازم برای درمان آنها بسیار زمان برند، از طرفی با توجه به این که هر آزمون قابلیت شناسایی یک میکروارگانیسم خاص را دارد، عدم امکان شناسایی سریع باعث شیوع بسیاری از بیماری ها می شود
بیناب نگاری فروشکست القایی - LIBS - یکی از ابزار های قدرتمند برای تجزیه و تحلیل همه عناصر تشکیل دهنده مواد به طور همزمان می باشد. دراین روش ثبت بیناب با سرعت بالا وبه صورت آنی انجام میشود. همچنین تجزیه و تحلیل بینابهای حاصل از آن به صورت درلحظه امکان پذیر است که خود موجب سرعت عمل بالای - LIBS - می شود. در کار حاضر از روش LIBS با کمک تحلیل تابع تشخیصی امکان جداسازی و تشخیص دو نوع باکتری به عنوان نماینده ای از گروه های گرم مثبت و گرم منفی بررسی شد.
-2 مواد و روش
طرح واره ای از چیدمان LIBS در شکل - 1 - نشان داده شده است. این چیدمان شامل یک لیزر Qسوئیچ Nd:YAG است که از طول موج 1064 نانومتر ،دیرپایی 5ns با نرخ تکرار 1 هرتز استفاده شده است. انرژی لیزر 163mJ/pulse تنظیم شده، برای کانونی سازی نورلیزر برروی نمونه از یک عدسی همگرا با فاصله کانونی 20cm استفاده شده، نمونه ها برای سهولت برروی یک پایه میکرومتری که در سه راستای xyz قابل تنظیم بود قرار گرفت. تابش حاصل از پلاسمای القایی لیزر توسط یک فیبر نوری که در فاصله یک سانتی متری از نمونه قرار دارد وبه سر آن یک عدسی متصل است جمع آوری وبه بیناب نگار S-150 با قدرت تفکیک 0.4 نانومتر در گستره 200تا800 نانومتر برای ثبت بیناب منتقل شد.
شکل :1 چیدمان LIBS
2-2 نمونه ها
ابتدا مقدار سه لیتر از هرکدام از سویههای IBRC- - M10742Bacillussubtilisگرممثبت - و - IBR-M11100Escherichia coliگرم منفی - تهیه شده از بانک میکروارگانیسم مرکز ملی ذخائر ژنتیکی وزیستی ایران درست شد. سپس محلول حاصل در دستگاه لیوفیلیزاسیون Christ مدل ALPHA2-4 LSC طی مراحلی در مدت زمان 20 ساعت در دمای-500C لیوفلیز شد. در نهایت پودر لیوفلیز باکتریها بااستفاده از دستگاه قرص ساز تبدیل به قرصهایی با قطر13mm وضخامت 2mm شدند.
2 - 2روش تحلیل تابع تشخیصی
تحلیل تابع تشخیص یک روش آماری است، که برای طبقه بندی مجموعه ای از مشاهدات به گروه های منحصر به فرد براساس مجموعه ای از متغیر های مستقل استفاده می شود. که در این پژوهش از آن برای دسته بندی دونمونه باکتری استفاده شده است. این تکنیک مجموعه از توابع خطی ایجاد می کند که روابط بین گروه ها را با کمترین خطا در طبقه بندی بدست می دهد. این روابط را می توان با به حداکثر رساندن نسبت واریانس بین گروهی به واریانس درون گروهی بدست آورد. تابع تشخیصی به چندین شکل در معادلات نشان داده می شود که رایج ترین آن معادله زیرمی باشد:
DF=b1x1+b2x2+...+bkxk+b
که در آن DF، تابع تشخیص و b1,b2'… مقادیر ضریب تشخیص یا ضریب وزنی هر متغیر و xk متغیرهای مستقل هستند. تعداد تابع تشخیص همیشه برابر تعداد طبقات متغیر منهای یک است. تحلیل تشخیصی شناسایی متغیر های تفکیک کننده را در دومرحله انجام میدهد . در مرحله اول از آزمون F - وبرحسب لاندای ویلکس - برای آزمون معنا داری کل مدل استفاده میشود؛ در مرحله بعد اگر مقدار F در مرحله اول معناداری مدل تشخیصی را نشان دهد، در آن صورت هر متغیر مستقل ارزیابی می شود تا مشخص شود میانگین کدام یک از آن ها تفاوت معناداری باهم دیگر برحسب گروه دارد که در نهایت از آنها برای طبقه بندی متغیر وابسته استفاده می شود. این تابع اطلاعات طیفی نمونه ها شامل شدت خطوط شاسایی شده در باکتری ها را به عنوان متغیر مستقل دریافت و بیشترین اختلافات را پیدا می کند. همه خطوط طیفی به یک اندازه درتابع تفکیک سهیم نیستند ومیزان اثر گذاری هر عنصررا ضرایب تابع تفکیک مشخص می کند
-3 نتایج و بحث
ابتدا با تابش لیزر درنقاط مختلف نمونهها برای هر قرص 20 طیف LIBS به دست آمد.به عنوان نمونه در شکلهای 2و3 به ترتیب طیفهای LIBS حاصل از نمونههای باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت مشاهده میشود. خطهای طیفی مشاهده شده در بینابها متعلق به 8 عنصر موجود در طیف باکتریها شامل گونههای منیزیم، کلسیم، آهن، پتاسیم، نیتروژن، اکسیژن و کربن که در جدول 2 درج شده، می باشند. همانطور که انتظار می رود - جدول - 2 ساختار طیفی هر دو نمونه مشابه میباشد و تفاوت کیفی، بین بیناب دو باکتری مشاهده نمیشود.
به منظور جداسازی نمونههایی با ساختارهای مولکولی متفاوت انواع روش های آماری را می توان جهت تعیین اختلاف بین خطوط طیفی مشابه به کار برد. دراین کار از روش تابع تشخیص استفاده شد. شدت خطوط موجود در جدول 2به عنوان متغیرهای مستقل جهت تعیین تابع تشخیص به کمک نرم افزار SPSS.ver22 مورد استفاده قرار گرفت نتیجه تفکیک در جدول 2خلاصه شده است.
جدول: 2 خطوط مربوط به گونه های شناسایی شده
