بخشی از مقاله
چکیده
پوسیدگی فوزاریوم سنبله یکی از بیماريهاي مخرب غلات دانه ریز در سراسر جهان میباشد. تجمع مایکوتوکسین در دانههاي برداشت شده جديترین تهدیدي است که بیماري فوزاریوم سنبله گندم به همراه دارد. امروزه تکنیکهاي مختلفی جهت شناسایی ژنهاي مقاومت به بیماري وجود دارد. با شناسایی این ژنها و انتقال آن به ارقام بومی میتوان از مصرف سموم و آلایندههاي خطرناك اجتناب نمود.
در این مطالعه از رقم مقاوم ونگشايباي جهت آنالیز بیان ژن با استفاده از تکنیک cDNA-AFLP استفاده گردید. در مرحله گلدهی سنبلههاي گندم تحت آلودگی مصنوعی با قارچ Fusarium graminearum و آب مقطر به عنوان شاهد در 6 زمان قرار گرفتند. نتایج آنالیز مقدماتی، بیان افتراقی قطعات مشتق شده از رونوشت در نتیجه حمله فوزاریوم را آشکار نمود. قطعات مناسب از روي ژل جداسازي، همسانه سازي و توالی یابی شدند و همولوژي آنها در بانک ژن مورد بررسی قرار گرفت. برخی از این ژنها در مکانیسمهاي انتقال سیگنال، دفاعی و واکنش به پاتوژن درگیر بودند.
مقدمه
بیماري فوزاریوم سنبله یکی از مهمترین بیماريهاي غلات در مناطق گرم و مرطوب جهان است که علاوه بر خسارت کمی، خسارت کیفی نیز به بار میآورد . Fusarium graminearum عامل بیماري بلایت فوزاریوم گندم، مایکوتوکسین دون1 را تولید میکند که از دسته تریکوتسنها میباشد و علاوه بر تشدید بیماریزایی قارچ عامل، مخاطراتی را براي سلامتی انسان و حیوانات در بر دارد
بیماريهاي قارچی هر ساله خسارت زیادي به محصولات کشاورزي وارد مینمایند. طولانی بودن روشهاي سنتی اصلاح براي ایجاد گیاهان مقاوم به بیماريهاي قارچی از یک سو و مشکلات مصرف سموم شیمیایی که پرهزینه بوده و باعث آلودگی محیط زیست شده و به دلیل تکامل عوامل بیماریزا کم اثر میگردند از سویی دیگر، بیانگر نیاز و اهمیت استفاده از ژنهاي مقاومت و فن آوريهاي جدید و کارآمد براي مقاوم نمودن گیاهان به پاتوژنهاي قارچی است
از راهکارهاي موجود جهت توسعه ارقام مقاوم، استفاده از تکنیک دورگه گیري و گزینش بعد از آن است که آن هم با توجه به منابع محدود مقاومت به اسکب در گندم معمولی و چند ژنی بودن آن چندان کارآمد نیست - . - 1 بدین ترتیب لزوم بررسی دقیقتر مکانیسم هاي مقاومت به بیماري در سطح مولکولی جهت استفاده بهینه در ارقام حساس بیش از پیش مورد نیاز میباشد
امروزه روشهاي مختلفی براي شناسایی ژنهاي درگیر در مسیرهاي دفاعی وجود دارد. روش cDNA-AFLP یکی از تکنیکهایی می باشد که کاربرد گستردهاي دارد، تکنولوژي بسیار حساس میباشد و تعیین خصوصیت بیان ژن در محدوده وسیعی از فرایندهاي بیولوژیکی را ممکن میسازد
مواد و روشها
رقم ونگشايباي یکی از ژرم پلاسمهاي چینی مقاوم به فوزاریوم سنبله گندم میباشد. در این مطالعه از رقم ونگشايباي جهت آنالیز بیان ژن استفاده گردید. این رقم در ایستگاه تحقیقات کشاورزي گرگان کشت گردید. در مرحله گلدهی سنبلهها تحت آلودگی با قارچ Fusarium graminearum و آب مقطر به عنوان شاهد قرار گرفت. نمونهبرداري از سنبلههاي آلوده در شش زمان پس از تلقیح - 0،6،12،24،48 و72 ساعت - انجام گرفت.
استخراج RNA کل با استفاده از بافر بایوزول - شرکت بیوفلکس، ژاپن - از سنبلههاي آلوده انجام گرفت. قطعات مشتق شده از رونوشتها، که از طریق نسخه برداري معکوس RNA پیامبر بوسیله آنزیمهاي برشی PstI و TagI ایجاد شده بودند، از طریق یک سري از آغازگرهاي انتخابی مورد غربال قرار گرفتند. قطعات cDNA که حاکی از بیان افتراقی ژن بودند، از روي ژل پلی اکریلامید جداسازي و سپس دوباره تکثیر یافتند. محصولات PCR تخلیص شده درون وکتور pJET1.2/blunt باکتري - Ecoliساخت شرکت فرمنتاز - الحاق یافتند و مورد توالییابی قرار گرفتند. جهت شناسایی همولوژي باندهاي توالییابی شده در بانک ژن از روشهاي بیوانفورماتیک BLASTN و BLASTX استفاده گردید.
نتایج و بحث
قطعات مشتق شده از رونوشت - - TDF، که بوسیله cDNA-AFLP آنالیز شده بود در اندازه 100-800 باز بودند. تعداد قطعات مشتق شده از رونوشت در هر کدام از 16 ترکیب پرایمري بکار برده شده، بین 30 تا 80 قطعه بود. الگوهاي باندي مشاهده شده به صورت زیر طبقه بندي شدند: - 1 باندهایی که در هر 6 زمان بیان یکسانی نشان دادند، این باندها جزء ژنهاي خانه دار و ویژه ژنوتیپ گندم میباشند، - 2 باندهایی که پس از حمله پاتوژن افزایش بیان نشان دادند، - 3باندهایی که پس از حمله پاتوژن کاهش بیان نشان دادند و - 4باندهایی که در نمونههاي شاهد حضور نداشتند و تنها پس از حمله پاتوژن بیان شدند.
شکل ١. الگوی بیان ژنھای گندم در رقم ونگشایبای تحت آلودگی با قارچ Fusarium graminearum با استفاده از تکنیک cDNA-AFLP، .A نمونهای از الگوی باندی ویژه از بین این قطعات حدود 150 باند مناسب که بیان افتراقی پس از حمله فوزاریوم نشان داده بودند از ژل پلی اکریلامید جداسازي و مجدد تکثیر شدند. 20 مورد از باندهاي تکثیر شده مورد کلون و توالی یابی قرار گرفتند.
نتایج بررسی همولوژي نشان داد که این ژنها با ژنهاي مختلف انتقال سیگنال، انرژي، واکنش به پاتوژن و نسخه برداري تشابه دارند. استینر و همکاران - - 4 نیز با آنالیز بیان ژن در ارقام مختلف گندم نسبت به پوسیدگی فوزاریوم سنبله توسط تکنیک cDNA-AFLP الگوهاي بیان افتراقی ژنها را مشاهده نمودند.
آنالیز cDNA-AFLP ابزاري آسان و مستقیم جهت کشف ژنهایی میباشد که به طور افتراقی در طی واکنش فوزاریوم-میزبان بیان میشوند. بیشتر مکانیسمهاي مولکولی در طی واکنش پاتوژن-میزبان هنوز ناشناختهاند. نتایج توالی یابی قطعات cDNA هدف، اطلاعات مهمی درباره عملکرد و ساختار ژنها ارائه میدهد. با شناسایی ژنهاي مقاومت و انتقال آن به ارقام بومی به میزان قابل توجه میتوان عملکرد و کیفیت محصول را افزایش داد و سبب کاهش مصرف سموم و در نتیجه کاهش مخاطرات زیست محیطی شد.
