بخشی از مقاله
چکیده
رملاتونین یا -Nراستیل--5رمتوکسی تریپتوفان که توسط عده صنوبري سنتز و در زمان تاریکی ترشح می شود در سال 1959رجداسازي ورساختمان آن توضیح داده شد.رملاتونین یک جزء بسیار مهم از سیستم کنترل زمان در داخل بدن به حساب می آید.ردر نتیجهربسیاري از فرایندرهاي فیزیولوژیکی مانند کنترل ساعات خواب، بلوغ و سازگاري فصلیررا بهر عهده دارد.راثر هورمون ملاتونین از طریق اتصال آن با گیرنده ملاتونین صورت می پذیرد.رهدف از این مطالعه بررسی چند شکلی در ژنرگیرنده ملاتونین - MTNR1A - در گوسفندرنژاد زندي بوده است.راستخراج DNAربه روش نمکی بهینه یافتهو تعیین ژنوتیپ با استفاده از تکنیک PCR-RFLP انجام گرفت. ردو آلل M رو N ربارفروانی 0/9109 رو 0/0891 رو دورژنوتیپ رMM روMN ربا فراوانیر0/82 رو 0/18 ردر جمعیت کوسفندان مورد مطالعه شناسایی شد. رمطالعه همبستگی بینژنوتیپ هاي مشاهده شده و صفات تولیدي در دست بررسی است.
کلمات کلیدي:رملاتونین، چند شکلی، گوسفند زنديرر
مقدمه
هورمون ملاتونین یا -Nرراستیل--5ررمتوکسی تریپتوفان در سال 1959رتوسط لرنر و همکاران جداسازي و ساختمان آن توضیح داده شد.راین هورمونرتوسط غده صنوبري سنتز و ترشح می شود ع1لا.رملاتونین ازرسیگنالرهايراندوژنوسیردر شرایط تاریکی است که بسیاري از فرایندرهاي فیزیولوژیکی مانند کنترل ساعات خواب، فصل زایش، بلوغ و سازگاري فصلیررا بر عهده داردرع4لا.رهورمون ملاتونینربه واسطه اثرات بازدارنده نور بر روي تحریکات چشمی-ررهیپوتالاموسی در روز ترشح نمی شود، لذارتغییرات سیکل نوري سالانه نقش مهمی را براي ملاتونین در تنظیم پروسه هاي فصلی به وجود می آوردرع1لا.
رملاتونین بسیاري از اعمالش را به واسطه اتصال آن بارگیرنده هایش انجام می دهد ع8لا.رملاتونین قسمت اعظم تاثیرات خود را به وسیله واکنش با دو سایت اتصال قوي به نام هاي MT1رو MT2 رکه از نوع گیرنده هاي متصل شونده به پروتینرGرمی باشندرانجام می دهدرع1لا.رگیرنده MT1رتنظیم کننده پاسخ هاي فصلی به ملاتونین است ع10، 11لا.ر جایگاه ژن گیرنده هاي ملاتونین روي کروموزوم شماره 26رگوسفند شناسایی شده است ع6لا.راین ژنرمتشکل از دو اگزون است که توسط یک اینترون از هم جدا شده اند ع9لا،روراگزون شماره 2راین ژن، گیرنده MT1ردر گوسفند را کد میرنمایدر ع6لا.راز دیدگاه ساختمانی MT1ر از 350 راسید آمینه تشکیل میرشود که با 60ردرصدر از زنجیره 362راسید آمینه اي MT2 یکسانراست عکشف1لا.ر هاي حاصله توسط مسر و همکاران در سال 1997رمنجر به تکثیر یک قطعه 824رجفت بازي از جایگاه ژنرهورمون ملاتونین در گوسفند شدرکه در نهایت منجر به شناساییردو جایگاهرRFLP، براي آنزیم هاي MnII و RsaIردر ژن گیرندهرملاتونین شده است.
البته براي آنزیم محدوالاثر MnIIرشش جایگاه برشی در توالی مورد نظر شناسایی شده که فقط در دو تا از این جایگاه ها چند شکلی مشاهده شدهراسترع2، 6، 7لا .ردر مورد آنزیم RsaIرنیز در دو جایگاه چند شکلیرمشاهده شدرع6لا. دریو و همکاران نیز در سال 1998راظهار داشتند که گیرنده MT2ردر گوسفند بیان نمی شود ع9لا. مالپوکس و همکاران در سال 2002ربیان کردند که مکان اتصال و رونویسی گیرنده MT1ربراي کنترل تولید مثل درگوسفند در غده هیپوتالاموسرمی باشدرع5لا. رنورترن و همکاران در سال 2003ر اثر ژن MTNR1Aررروي باروري و چند قلوزایی را بررسی کردند.رمیش هاي بالغ با ژنوتیپ MMرتقریبا 0/11رکمتر از دیگر ژنوتیپ ها در هر زایش تولید بره داشتند ع7لا.
مواد و روش ها
خونگیري و استخراج DNA
از میش هاي نژاد زندي موجود در مرکز اصلاح نژاد قوچ زندي وابسته به سازمان جهاد کشاورزي استان تهران به تعداد 100رراس به صورت تصادفی خونرگیري از سیاهرگ وداجی انجام و جهت استخراج DNA از روش نمکی بهینه یافته استفاده شد.
تکثیر قطعات مورد نظر با PCR
واکنش PCRرجهت تکثیر قطعات مورد نظر در حجم 25رمیکرولیتر با استفاده از آغازگر هاي رفت 5’-TGT GTT TGT GGT GAG CCT GG-3’رو برگشت:5’-ATG GAG AGG GTT TGC GTT TA-3’ رانجام شد ع6لا.راین واکنش حاوي1/5رمیکرولیتررديرانرآ، 2/5رمیکرولیتر بافر پی رسیرآر 1x، 1/25رمیکرولیتر Mgcl2 ر50رمیلی مولار، 1رمیکرولیتر از هر آغازگر، 0/5رمیکرولیتر از مخلوط ديرانرتیرپی و 0/2رمیکرولیتر آنزیم تک پلی مراز وربراي رسیدن به حجم مورد نظر از آب مقطر استفاده شد.رمراحل واکنش شامل واسرشته سازي ابتدایی در دماي 95ردرجه سانتی گراد براي 5ردقیقه، و 35ر سیکل شاملر95 ردرجه به مدتر30رثانیه جهت واسرشته سازي، 58 رتار63 ردرجه براير30رثانیه جهت اتصال آغازگرها عدماهاير62-63-58رهرکدام 5رسیکل و مابقی 10سیکللارو 30رثانیه در دماي 72ردرجه جهت تکثیر وربسط نهایی شامل 10ردقیقه در دماي 72ردرجه سانتی گراد انجام گرفت.
تعیین ژنوتیپ
در بررسی چند شکلی در جایگاه گیرندهرملاتونین 1Aرازرآنزیم محدودالاثررMnIIراستفاده شد.رجهت هضم آنزیمی، حجم نهایی واکنش 15رمیکرولیتر در نظر گرفته شد.رمیزان محصول PCRر، آنزیم و بافر آنزیم مورد استفاده براي هضم به ترتیب 7، 0/5رو 1رمیکرولیتر در نظر گرفته شد.رنمونه ها در بن ماري و در دماي 37ردرجه سانتیگراد براي 4رساعت قرار گرفته و سپس نمونه ها روي ژل آگارز 3ردرصد الکتروفورز شد.رپس از رنگ آمیزي با اتیدیوم بروماید، محصولات هضم مورد شناسایی قرار گرفته ورآنالیزروفور ژنی و ژنوتیپی با شمارش مستقیم ژنوتیپ هارانجام پذیرفت.
نتایج:
از تکثیر نشانگر MTNR1A قطعه ايربه اندازهر824رجفت باز ازراگزون شماره 2راین ژن حاصل شد که روي ژل آگارز 1/5ردرصد موردرشناسایی قرار گرفت عشکل 1لا.رپس از رنگ آمیزي ژل مربوط به محصولات هضم شده با آنزیم MnII ژنوتیپ ها مورد شناسایی قرار گرفتند.ردر مجموع2رژنوتیپرشامل MM عقطعات 286، 236، 216، 137، 82 و67رجفت بازيلا و MNرعقطعات 236، 216، 137، 82رو67رجفت بازيلارمشاهده شد که با نتایج مسر و همکاران مطابقت رداشت.رع6لارعشکل 2لا.رفراوانی آلل M،ر0/9109رو آلل Nر برابر با 0/0891ر و فراوانیرژنوتیپ هاي MMرو MNربه ترتیب 0/82 و 0/18ربرآورد شد.رجمعیت گوسفندان زندي مورد مطالعه براي این نشانگر در تعادلرهاردي-رواینبرگرقرار نداشتند.ررر
بحث
اندازه رقطعه رتکثیر شده نشانگرراز اگزون شماره 2رژنرMTNR1Aردر این تحقیق درحدود 824ررجفت باز بوده است.ر هضمراین قطعه با آنزیم MnII رایجاد شش قطعه نمودهرکه این نتایج با نتایج مسر و همکاران در سال 1997رع6لارنورتر و همکاران در سال 2003رع7لارمطابقت دارد.راین نشانگر در جمعیت گوسفندان زندي مورد مطالعه داراي 2رآللرMرو Nربا فراوانی، 0/911رو 0/089 رو فراوانی ژنوتیپیMM رو MNربه ترتیب 0/82رور0/18رمحاسبه شد.رجمعیت گوسفندان زندي مورد مطالعه براي این نشانگر در تعادل هاردي- واینبرگ قرار نداشتند. رتوصیه می شود که جهت مطالعات بعدي از تعداد نمونه هاي بیشتر جهت تعیین ژنوتیپ استفاده شود. رآنالیز همبستگی ژنوتیپی با صفات تولیدي و تولید مثلی در دست بررسی است.
