بخشی از مقاله
چکیده
براي مطالعه تنوع ژنتیکی در بین ارقام زیتون ، تعداد 10 رقم زیتون ایرانی و خارجی از مرکز تحقیقات زیتون علی آباد رود بار جمع آوري گردید. در این پژوهش از 55 نشانگر ISSR استفاده شد که از این میان 14 نشانگر داراي بهترین باندها با بالاترین وضوح بودند. میانگین تعداد آللها براي هر لو کوس در حدود 17 آلل با دامنه 8 تا 26 آلل بود. میانگین محتواي اطلاعات چند شکلی - PIC - در حدود 0/3 بدست آمد که بالاترین PIC مربوط به آغازگر UBC-841 با مقدار 0/37 بود.
شباهت ژنتیکی بر اساس ضریب تشابه جاکارد دامنه اي در حدود - 0/45 ارقام کرونائیکی و مانزانیلا - تا 0/72 - ارقام شنگه و فیشمی - داشت. ارتباط ژنتیکی بین واریته ها با استفاده از آنالیز کلاستر و PCA محاسبه گردید و واریته ها به دو گروه اصلی طبقه بندي شدند . نتایج بدست آمده نشان میدهد که ارقام ایرانی در داخل جمعیت خود داراي تنوع بسیار مفیدي هستند که میتوان از آن در برنامه هاي اصلاحی بهره برد.
مقدمه
استفاده از نشانگرهاي مولکولی در ارزیابی تنوع ژنتیکی واریته هاي درخت زیتون - Olea earopaea L. - و شناسایی دقیق و مطمئن ژنوتیپها ، یکی از بهترین روشها می باشد - . - 11 شناسایی مولکولی واریتهها با ایجاد پروفایل مولکولی براي هر واریته قادر است واریته ها را به درستی شناسایی کند . - 11 - ازبین نشانگرهاي مولکولی، RAPD جزء اولین نشانگرهاي استفاده شده براي این بررسی بود.مزایاي این تکنیک مثل استفاده آسان، هزینه پایین ونیاز به مقدار کمی ازمواد گیاهی در مسیر انجام کار، این روش را توسعه داد - . - 3
از طرفی محدودیت هاي این نشانگر مثل غالب بودن وحساسیت به شرایط واکنش منجر به توسعه تکنیک هایی مثل 1 - SSR،2،5، - 10 و13 - AFLP، - 14 شد. بدلیل تکرار پذیري کم وحساسیت بالاي نشانگرهاي RAPD به شرایط آزمایشگاهی ، هزینه بالاي کاربرد نشانگرهاي AFLP ونیازبه داشتن اطلاعات در مورد توالی ژنوم براي استفاده ازنشانگرهاي SSR، در این پژوهش از نشانگرهاي ISSR براي مطالعه وبررسی ارقام زیتون استفاده شده است. این نشانگرها به تنهایی یا به همراه سایر نشانگرهاي مولکولی براي شناسایی و تفکیک ارقام زیتون مورد استفاده قرارمیگیرند.
آغازگر هاي ISSR به تکثیر قطعاتی از DNA قرار گرفته در بین دو ناحیه تکرار شده ریز ماهواره که در دو جهت خلاف هم قرار گرفتهاند میپردازد. توالیهاي ریز ماهواره، در واقع بهعنوان آغازگرهایی براي نشانگرهاي ISSR عمل میکنند و میتوانند بصورت دي نوکلئوتیدي ، تري نوکلئوتیدي ، تتراکلئوتیدي یا پنتانوکلئوتیدي باشند. آغازگرهاي مورد استفاده ممکن است فاقد انتهاي چسبنده باشند ، ولیاکثرا دارايانتهاي چسبنده5َ یاَ3هستند که با ساخت 4-1 باز به طرف توالیهاي کناري گسترش پیدا میکنند - . - 7
تکنیک ISSR آسان و سریع است ونیازي به استفاده از رادیو اکتیو ندارد. این نشانگرها معمولا چند شکلی بالایی را نشان میدهند . - 9 - حتی اگر سطوح چند شکلی نشان داده شده متفاوت باشند با استفاده از این روش تشخیص داده میشوند. تکرار پذیري مطلوب ، وراثت غالب و همولوژي محصولات تکثیر شده، از مهمترین ویژگیهاي مارکرهاي ISSR محسوب میشوند.
با توجه به خصوصیات نشانگرهاي ISSR و سودمندي آنها در شناسایی و تمایز واریته ها در مطالعه حاضر از این نشانگر استفاده شده است تا چند شکلی موجود در بین 10 واریته جمع آوري شده زیتون از منطقه علی آباد رود بار بررسی گردد. مواد و روش ها تهیه نمونه گیاهی: نمونههاي برگی زیتون مورد استفاده در این مطالعه از مرکز تحقیقات علی آباد رودبارجمع آوري گردید - جدول . - 1
استخراج :DNA استخراج DNA برمبناي روش CTAB با اندکی تغییرات انجام شد - DNA. - 4 استخراج شده در ژل آگاروز 0/8 درصد بار گذاري و براي اطلاع از کمیت و کیفیت آن از دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده شد - شکل . - 1 اجراي مراحل :ISSR آزمایشات ISSR بر اساس روش سیک و همکاران با کمی تغییر بهینه سازي شد. بعد از سنجش میزان غلظت DNA استخراج شده، نمونههاي 50 نانوگرمی از این نمونه ها تهیه شد گزینش آغازگر ها با استفاده از سه نمونه ي DNA از بین 55 آغازگر انجام گرفت.
تجزیه دادهها : هریک از مکانهاي تکثیر شده توسط نشانگر به عنوان یک آلل در نظرگرفته شد و حضور و عدم حضور آنها به ترتیب با اعداد یک و صفر به نمایش درآمد.سپس داده ها به نرم افزار Excel منتقل شده و فاصله ژنتیکی بر اساس ضریب شباهت جا کارد توسط نرم افزار NTYSIS محاسبه گردید. گروهبندي ارقام نیز براساس روش UPGMA و تجزیه مولفههاي اصلی - - PCA توسط این نرمافزارانجام شد.
نتایج و بحث
بعد از گزینش 14 آغازگر از بین 55 آغازگر اولیه و انجام PCR، مجموعا 240 باند قابل امتیازدهی مشاهده شد، که اندازهي آنها در محدوده 250-10000 جفت باز بود و از بین آنها تعداد 199 نوار 82/9 - درصد - چند شکلی نشان دادند. ارقام کرونائیکی و مانزانیلا داراي کمترین شباهت ژنتیکی و ارقام شنگه و فیشمی داراي بیشترین شباهت به یکدیگر هستند نتایج تجزیه و تحلیل خوشهاي، 2 گروه اصلی را بین10 نمونهي زیتون مشخص نمود - شکل2، سمت راست - . گروه اول شامل واریتههاي ماري، زرد، فیشمی ، شنگه، مانزانیلا و گروه دوم شامل واریتههاي کنسروالیا، میشن، لچینو، کرونائیکی و روغنی بودند .
در گروه اول تمام ارقام بجز رقم مانزانیلا جزو واریتههاي بومی ایران هستند همچنین در گروه دوم بجز رقم روغنی تمام ارقام جزو واریتههاي کشورهاي خارجی به حساب می آیند. با تجزیه و تحلیل دندوگرام حاصل و قرار گرفتن رقم مانزانیلا در گروه اول مشخص میشود که این رقم داراي بیشترین شباهت ژنتیکی با ارقام بومی ایران میباشد. رقم روغنی نیز که بومی ایران است و در گروه دوم قرار گرفته است، شباهت ژنتیکی بالایی با ارقام خارجی نشان داده است.
با توجه به نتایج بدست آمده از تجزیه PCA ، ارقام مورد مطالعه در چهار گروه مجزا قرار گرفتند ، گروه اول شامل ارقام ایرانی و گروه دوم شامل ارقام خارجی بودند گروه سوم تنها شامل رقم روغنی و گروه چهارم تنها رقم مانزانیلا را شامل میشد.از طرف دیگر نتایج این پژوهش نشان میدهد تفکیک ارقام ایرانی و خارجی توسط تجزیه PCA نسبت به تجزیه کلاستر بهتر بوده و با دقت بیشتري انجام میشود.نتایج بدست آمده بر مبناي ضریب تشابه جا کارد ، با دامنه شباهتی در حدود -0/35-0/36 و فواصل مشاهده شده بین نمونه ها در نمودارهاي توزیع دوبعدي PCA ، حاکی از تفاوت و فاصله ارقام و لاینهاي مورد بررسی است.
نتایج فوق سطح تنوع ژنتیکی بالایی را در داخل جمعیت واریتههاي زیتون ایرانی و خارجی نشان میدهد . این تنوع نشان از گستردگی منابع ژنتیکی در گیاه مذکور دارد بطوریکه میتوان در کارهاي اصلاحی از ذخایر ژنتیکی موجود در کشور و واریتههاي بومی بهره برد و این موضوع در پروژه هاي مربوط به اصلاح اینگیاهبسیارحائزاهمیتاست.
