بخشی از مقاله
مقدمه: ژنوم پروکاریوتها و یوکاریوتها حاوي میزان قابل توجهی از توالیهاي تکراري است. در مواردي استخراج نواحی تکراري از ژنوم و بدست آوردن محصولات آنها براي مطالعات بیشتر و اهداف ایمنیزایی مهم است. به دلیل ماهیت تکراري، طراحی پرایمر اختصاصی براي این نواحی مشکل است. در این پژوهش روشی ابتکاري براي انتخاب پرایمر براي نواحی تکراري ژنوم ارائه شده است.
روشها: توالی ژن پروتئین بیوفیلمی از ژنوم Acinetobacter baumannii که داراي تکرارهاي متعددي از هفت الگوي متفاوت است از بانک اطلاعاتی استخراج گردید. تمامی الگوهاي تکراري از نوکلئوتیدها جداگانه با هم همردیف شدند. بعد از در نظر گرفتن نواحی مورد نظر، پرایمرها از میان فایلهاي همردیفی انتخاب شده و با همردیفی دوگانه با کل ژن، اختصاصی بودن آنها تایید شد.
واکنش زنجیرهاي پلیمراز با استفاده از ژنوم استخراج شده و پرایمرهاي طراحی شده انجام گرفت. صحت آزمایش با مشاهدهي باندهاي مورد انتظار براي قطعات و محصول هضم آنزیمی آنها، بر روي ژل آگارز بررسی شد. همچنین یکی از قطعات در حامل پلاسمیدي pET28a همسانه سازي گردید. این کانستراکت در سلولهاي E.coli BL21DE3 تراریخت شد، از کلون هاي حاصل تخلیص پلاسمید صورت گرفت و کانستراکت انتخابی تعیین توالی گردید.
نتایج: در این پژوهش پرایمرها براي واکنش - amplification refractory mutation system - ARMS PCR طراحی شد. مشاهدهي باندهاي مورد انتظار بر روي ژل حکایت از صحت و کارایی روش بکار گفته شده دارد.
مقدمه
توالیهاي تکراري در بسیاري از پروتئینها شناخته شده است . - 1 - از جمله این پروتئینها میتوان به - 2 - Ankyrin repeats، - 7 - Armadillo repeat در یوکاریوتها و ادهسینها و یا برخی از آنزیمها نظیر lipopolysaccharide-modifying enzymes در پروکاریوتها - 9 - اشاره کرد. بسیاري از باکتريهاي پاتوژن از طبیعت تغییر پذیر این توالیها براي ایجاد تغییر در آنتیژنهاي سطحی خود و در نتیجه فرار از سیستم ایمنی استفاده میکنند . - 8 -
از آنجا که بسیاري از عوامل ویرولانس سطحی باکتريها محتوي توالیهاي تکراري هستند - 9 - و پروتئینهاي داراي توالیهاي تکراري بهعنوان اهداف مناسبی براي سلولهاي B شناخته میشوند - 3 - ، با داشتن چنین شرایطی، این عوامل سطحی نامزد مناسبی براي اهداف ایمنیزایی است. استخراج نواحی خاصی از ژنوم که داراي توالی تکراریست کاري پیچیده است چراکه با در نظر داشتن این محتواي تکراري، طراحی پرایمر براي این نواحی مشکل است.
در این پژوهش از روشی ابتکاري براي پیدا کردن نواحی ویژه براي طراحی پرایمر اختصاصی استفاده شده است. این روش براي استخراج سه ناحیهي خاص از پروتئین بیوفیلمی Acinetobacter baumannii به کار گرفته شد. پروتئینهاي بیوفیلمی از جمله عوامل ویرولانس باکتریایی هستند که در اتصال سلولها به سطوح مختلف دخالت دارند و حاوي الگوهاي متعددي از توالیهاي تکراري هستند . - 4 -
بیوفیلم پروتئین Acinetobacter baumannii ، - Biofilm Associated Protein - Bap با 8620 اسید آمینه، pI پیشبینی شدهي حدود 3 و وزن مولکولی حدود 835 kDa یکی از بزرگترین و اسیدي ترین پروتئینهاي پروکاریوتی است . - 5 - این پروتئین شامل تکرارهاي متوالی از هفت الگوي مختلف است. این الگوها از A تا G نام گذاري شدهاند؛ در این پروتئین پنج رونوشت از واحد 54 - A تا 99 % - ، 22 رونوشت از تکرار 72 - B تا - %100، 21 رونوشت از تکرار 73 - C تا - %100، 28 رونوشت از تکرار 78 - D تا - %100، 2 رونوشت از تکرار - % 62 - E، 2 رونوشت از تکرار - % 67 - F و 3 رونوشت از تکرار 36 - G تا - %51 وجود دارد.
روشها -1 طراحی پرایمر
توالی ژن مورد نظر - Accession No. 159797905 - از بانک اطلاعاتی استخراج گردید بعد از در نظر گرفتن نواحی مطلوب براي هدف این پژوهش، براي هر قسمت پرایمر طراحی شد. به این منظور تمامی توالیهاي تکراري در ژن بیوفیلم پروتئین A. baumannii ، جداگانه با هم، همردیف شدند. براي همردیفی از نرمافزار CluctalW استفاده شد.
این برنامه در نرمافزار CLC-Protein workbench 5 - limited mode - اجرا شد. فایلهاي همردیفی در همین نرمافزار بررسی شدند و پرایمرهاي مناسب از نواحی مناسب ژن، در همین فایل همردیفی انتخاب گردیدند. دو یا سه نوکلئوتید انتهاي 3ّ باعث اختصاصی شدن این پرایمرها میشوند. هر کدام از پرایمرها با نرم افزار LALIGN در وبگاه http://evol.mcmaster.ca/Pise/5.a/lalign.html با کل ژن همردیف شدند. این نرمافزار با اجراي همردیفی دوگانه، راه مناسبی براي انتخاب پرایمرهاي اختصاصی بود. در نهایت جایگاه برش آنزیم محدود کننده با توجه به وجود یا عدم وجود آن در توالی مورد نظر، در انتهاي پرایمر قرار داده شد.
-2 واکنش زنجیرهاي پلیمراز - PCR - و تعیین صحت محصولات واکنش
ژنوم باکتري A. baumannii با روش لیز قلیایی تخلیص شد. فراوان سازي قطعات سهگانهي انتخاب شده از ژن bap توسط پرایمرهاي رفت و برگشت با آنزیم Taq DNA pol انجام شد. محصول واکنش توسط کیت تخلیص محصول PCR، خالص شد و جهت تأیید محصول واکنش زنجیرهاي پلیمراز، از آنزیمهاي محدود کننده استفاده شد.
درستی برش و ایجاد باندهاي قابل استناد، گواه صحت عمل تکثیر قطعه ژن مورد نظر است. با بررسی توسط نرم افزار CLC معین شد که آنزیم محدود کنندهيPstI قطعات یک ودو و آنزیم BclI ، قطعهي سه را به دو قسمت تبدیل میکند، بنابراین عمل هضم آنزیمی قطعات یک ودو توسط آنزیم PstI در دماي 37 درجه سانتیگراد و هضم قطعهي سه توسط آنزیم BclI در دماي 55 درجه سانتیگراد صورت گرفت.
همسانه سازي و تعیین توالی
براي تاییدنهایی، یکی از قطعات - قطعهي شمارهي - 3 توسط آنزیمهاي محدودکنندهي EcoRI و HindIII مورد هضم قرار گرفت و در حامل پلاسمیدي pET28a همسانه سازي گردید. این کانستراکت در سلولهاي E.coli BL21DE3 تراریخت شد و بعد از غربالسازي در محیط کشت LB حاوي کانامایسین، از کلونهاي حاصل تخلیص پلاسمید صورت گرفت و بعد از هضم آنزیمی توسط آنزیم هاي محدود کنندهي فوقالذکر جهت تحلیل اولیه، کانستراکت انتخابی براي تعیین توالی به شرکت ژن فنآوران ارسال گردید.
نتایج
نکات اساسی در طراحی پرایمر در اینجا مورد توجه قرار گرفت. پرایمرها براي تکنیک amplification ARMS PCR - 6 - refractory mutation system طراحی شدند. استفاده از همردیفی، مراحل انتخاب پرایمر اختصاصی را بسیار ساده کرد. نمونهاي از فایل همردیفی در شکل 1 نشان داده شده است.
