بخشی از مقاله
چکیده:
پژمردگی ورتیسیلیومی زیتون که در تمام مناطق تحت کشت این محصول گسترش دارد، یک بیماري جدي است که منجر به کاهش عملکرد و مرگ درخت می گردد. ایزوله هاي Verticillium dahliae آلوده کننده زیتون به دو دسته پاتوتایپ هاي برگ ریز - D - و غیر برگ ریز - ND - دسته بندي می شوند که به ترتیب داراي خصوصیت تهاجمی بالا و پایین هستند.
اطلاع از نوع پاتوتایپ آلوده کننده گیاه می تواند در روش هاي مدیریتی آن مؤثر باشد. در این تحقیق با هدف استفاده از روش هاي مولکولی براي شناسایی این قارچ، از درختان زیتون مشکوك به پژمردگی ورتیسیلیومی در منطقه طارم زنجان بنمونه برداري شد. با استفاده از روش هاي معمول، کشت و خالص سازي قارچ ورتیسیلیوم انجام گردیدمتعاقباً. DNA این جدایه ها استخراج شده و واکنش PCR و Nested-PCR با استفاده از پرایمرهاي طراحی شده اختصاصی دو نوع پاتوتایپ انجام شد. نتایج این تحقیق نشان داد که تمام پاتوتایپ هاي مورد مطالعه در این تحقیق از نوع ND می باشند.
مقدمه:
زیتون - Olea europaea L. - یکی از اولین گونه هاي درختی اهلی شده و کشت شده است که داراي اهمیت تاریخی، اجتماعی و اقتصادي می باشد. اما آینده آن به عنوان یک محصول استراتژي در کشاورزي مناطق مدیترانه اي توسط تنش هاي زنده - آفات و بیماري هاي قدیمی و جدید - و غیر زنده - فرسایش، تغییرات کلیمایی - مختلف تهدید می شوند. یکی از مهم ترین محدودیت هاي کشت زیتون پژمردگی ورتیسیلیومی می باشد. این بیماري یک بیماري آوندي است که توسط قارچ خاکزاد Verticillium dahliae Kleb. ایجاد می شود
ایزوله هاي V. dahliae متعلق دو پاتوتایپ مجزا هستند: انواع برگ ریز - Defoliating، - D و غیر برگ ریز - Nondefoliating، . - 7 - - ND بطور کلی پاتوتایپ هاي نوع D مهاجم تر از از پاتوتایپ هاي نوع ND هستند و درون گیاهان آلوده سریع تر گسترش می یابند . - 3 - درختان زیتون حتی در سطوح آلودگی پایین نیز حساسیت بالایی به پاتوتایپ D از خود نشان می دهند . - 9 - آلودگی با این پاتوتایپ می تواند براي گیاه کشنده باشد، اما گیاهان زیتون آلوده شده توسط پاتوتایپ ND می توانند بهبود یابند . - 4 - بنابراین شناسایی دقیق پاتوتایپ در V.
Dahliae آلوده کننده زیتون مرحله مهمی در مدیریت بیماري پژمردگی ورتیسیلیومی،خصوصاً در یافتن منابع مقاومت به آن محسوب می شود. شناسایی زودهنگام، سریع و قابل اطمینان گیاهان آلوده به پاتوتایپ D به مدیریت پژمردگی ورتیسیلیومی و جلوگیري از شیوع آن به مناطق جدید، بویژه اگر آن مناطق آلوده نباشند، کمک می کند
راهی براي کنترل مطلوب V. dahliae فراهم نشده است زیرا میکرواسکلروت این پاتوژن در خاك براي چندین سال حضور دارد . - 7 - بنابراین، بیشتر روشهاي کنترلی براي مغلوب ساختن ورتیسلیوم در زیتون روي کاشت ارقام مقاوم متمرکز شده است
از طرف دیگر علایم بیماري ممکن است تحت تاثیر عوامل محیطی و رقم در آزمون هاي بیماریزایی قرار گرفته و بسیار متغییر باشد
در حال حاضر استفاده از تکنیک هاي ملکولی کمک شایانی به تعیین پاتوتایپ هاي قارچ V. dahlia نموده است به طوریکه در یک مدت زمانی کوتاه و بدون نیاز به آزمون هاي بیماریزایی و تنها با استفاده ازمقدار اندکی DNA می توان پاتوتایپ قارچ عامل بیماري را مشخص نمود. پرایمرهایی تخصصی براي شناسایی پاتوتایپ هاي D و ND، V. dahliae در زیتون آلوده توسط Mercado-Blanco و همکاران 2001 - ، - 2002 طراحی شده است که با استفاده از تکنیک Nested-PCR می توان از آن ها براي شناسایی دو نوع پاتوتایپ استفاده نمود.
هدف از این مطالعه شناسایی نوع پاتوتایپ ورتیسیلیوم آلوده کننده درختان زیتون موجود در برخی از نواحی منطقه طارم براي برنامه ریزي روش هاي مدیریتی مناسب جهت مدیریت این بیماري در منطقه می باشد . در این آزمایش از روش Nested-PCR براي شناسایی پاتوتایپ هاي ورتیسیلیومی آلوده کننده منطقه طارم استفاده شد.
مواد و روش ها:
نمونه برداري از سرشاخه ها و ساقه هاي مشکوك به آلودگی با داشتن علایمی مانند پژمردگی، سبز خشک شدن و ریزش برگ ها و قهوه اي شدن آوندي از باغات زیتون شهرستان طارم انجام گرفت. نمونه ها به محیط کشت اختصاصی Czapec-Dox agar منتقل و به مدت 12 روز در شرایط تاریکی و دماي 24°C نگهداري شدند. ورتیسیلیوم بعد از خالص سازي در محیط جامد به محیط مایع - Potato dextrose broth - PDB که به روش - 1985 - MacFaddin تهیه شده بود انتقال داده شد. استخراج DNA به روش CTAB و از میسیلوم هاي تکثیر شده در محیط PDB صورت گرفت.
پس از استخراج DNA واکنش Nested-PCR انجام گرفت که توالی آغازگرهاي اختصاصی پاتوتیپ هاي D و ND مورد استفاده در این واکنش در جدول 1 و اجزا و غلظت مواد مورد نیاز آن و برنامه حرارتی بر اساس روش 2001 - Mercado-Blanco و - 2002 بترتیب در جداول 2 و 3 آمده است.
جدول - 1 توالی آغازگر هاي اختصاصی پاتوتیپ هاي D و ND مورد استفاده در آزمون Nested-PCR
جدول -2اجزا و غلظت مواد مورد نیاز براي آزمون Nested-PCR جدول -3 برنامه حرارتی مورد استفاده در single-PCR و Nested-PCR
دو جفت آغازگر اشاره شده در جدول 1 پاتوتیپ D و سه جفت پرایمر اشاره شده در جدول 2 پاتوتیپ ND قطعاتی از ژنوم قارچ V.dahliae را در Nested PCR تکثیر مینمایند. به نحوي که آغازگرهاي - VD1F/VD1R - در دور اول PCR محصولاتی به اندازه 548bp و جفت دوم که شامل آغازگرهاي - INTD2R/INTD2F - هستند در Nested- PCR محصولاتی به اندازه 462bp تولید مینمایند . - 15 - جفت اول پرایمرهاي ND یعنی - NDf/NDr - در bp single-PCR
1410 و دو جفت بعدي - INTND2R/INTND2F - و - - INTNDr/INTNDf در 1163bp Nested-PCR تولید می کند
