بخشی از مقاله
چکیده
در این مطالعه پراآنش ژن هاي cry موثر بر ﳕاتد ها در بﲔ 70 ایزوله بومی Bt - Bacillus thuringiensis - مورد ارزیابی قرار گرفت. ارزیابی ها با استفاده از شکل مورفولوژیک آریستال ها با استفاده از میکروسکوپ نوري، الگوي پروتئیﲏ با استفاده از SDS-PAGE و آزمایشات PCR اﳒام گرفت. ژن هاي مورد بررسی شامل cry5, cry6, cry13, cry14,cry21 بودند.
اشکال متفاوت آریستال و نیز الگوي پروتئیﲏ متنوع در بﲔ ایزوله ها دیده شد. در این ﲢقیق پنج ترآیب ژنی موثر بر ﳕاتود مشاهده شد آه براي اولﲔ بار گزارش گردید و در مطالعات قبلی دیده نشده بودند. ژن cry6 با فراوانی % 24 /2 بیشﱰین فراوانی را به خود اختصاص داد و بدنبال آن cry14 با % 12/8 ، cry21 با % 4 /2 و cry5 با % 2 /8 به ترتیب بیشﱰین فراوانی را داشتند.
پروفیلی آه بیشﱰین فراوانی را داشت تنها حاوي ژن cry6 بود. تست آشندگی - زیست سنجی - بر روي ﳕاتد هاي آزاد شامل cephalobus persegnis و aphelenchus avenae صورت گرفت. ایزوله s2 با %70 آشندگی بیشﱰین آشندگی را نشان داد.نکته قابل توجه اینکه این سویه فقط حاوي ژن cry5 بود. نتایج ﲣقیق نشان داد آه سویه هاي بومی Bt ایران حاوي تقریبا اغلب ژن هاي موثر بر ﳕاتد ها می باشند و می توانند در برنامه هاي آنﱰل بیولوژیک ﳕاتودها مورد ارزیابی قرار گﲑند. زیست سنجی بر روي ﳕاتد هاي انگل گیاهی و تواﱄ یابی ژن هاي مشکوك جدید موثر بر ﳕاتد ها در دست اﳒام است.
مقدمه
باآﱰي Bt یک باآﱰي گرم مثبت ، اسپورزا و خاآزي است آه بیشﱰین تولید آفت آش هاي بیولوژیک را به خود اختصاص داده است . - 6 - خاصیت آفت آشی و حشره آشی Bt نتیجه بیان ژن هاي cry می باشد. تا به حال حدود 380 ژن از ژن هاي cry شناسایی شده است آه در خانواده هاي و زیر خانواده هاي ﳐتلفی طبقه بندي می شوند
هر خانواده از این ژن ها بر طیف خاصی از حشرات به صورت اختصاصی اثر می گذارند. براي مثال cry1,cry9,… بر علیه بالپولکداران، cry2,cry4,… بر علیه دوبالان، cry3, cry8,… بر علیه سخت بالپوشان و cry5, cry6 بر علیه ﳕاتدها موثرند.
ﲣمﲔ زده می شود آه بیش از 100000 گونه ﳕاتد وجود داشته باشد آه بیشﱰ آهنا در خاك زندگی می آنند و از باآﱰي ها تغذیه آرده و آهنا را می بلعند . - 4 - بعضی از ﳕاتد ها انگل هستند و بعضی از آهنا بصورت آزاد زندگی می آنند.
ﳕاتد هاي انگل گیاهی دامنه وسیعی از ﳏصولات زراعی را مورد هدف قرار می دهند آه ﳘه ساله منجر به زیان هاي زیادي در ﳏصولات آشاورزي می شوند . - 9 - در حال حاضر از روش هاي ﳐتلفی براي آنﱰل ﳕاتد ها استفاده می شود. براي مثال می توان به تناوب زراعی و سم پاشی با ﲰوم تدخیﲏ آه آلودگی خاك و ﳏیط زیست را به ﳘراه دارد اشاره ﳕود.
اﳚاد گیاهان مقاوم از طریق خاموشی ژن نیز از معدود آارهایی است آه دانشمندان سعی دارند با خسارت ﳕاتد ها مقابله آنند . - 3 - با توجه به وجود گزارش هایی مبﲏ بر اثر توآسﲔ هاي cry بر علیه ﳕاتدها - 4و - 5، تاآنون در دنیا آارهاي بسیارآمی در مورد غربال این ژن ها، شناسایی الگوي پروتئیﲏ و شکل آریستال آهنا، و نیز اثر این توآسﲔ ها بر روي ﳕاتد هاي انگل و آفت ﳏصولات آشاورزي صورت گرفته است. در این مطالعه وجود این ژن ها در ایزوله هاي Bt بومی ایران، شکل آریستال ها و الگوي پروتئیﲏ آهنا و میزان اثر آهنا بر روي ﳕاتدهاي آزاد و انگل مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد و روش ها
هفتاد ایزوله Bt از ﳕونه هاي خاك نواحی ﳐتلف آشاورزي ایران جداسازي گردید.استخراج اسپور آریستال با استفاده از روش هاي موجود صورت گرفت. مشاهده شکل آریستال ها با استفاده از رنگ آمیزي گرم و میکروسکوپ هاي نوري و فاز آنﱰاست اﳒام شد.
استخراج DNA به روش CTAB و لیز آردن باآﱰي اﳒام گرفت. بررسی الگوي پروتئیﲏ با استفاده از %10 SDS-PAGE و %12 اﳒام گرفت. برخی پراﳝر ها بر اساس مقاله اجیوفور و ﳘکاران - 2002 - و برخی نیز بر اساس تواﱄ ژن هاي شناسایی شده موثر بر ﳕاتودها سنتز گردید. ﳕاتد هاي cephalobus persegnis و aphelenchus avenae از مزارع گوجه فرنگی اطراف آرج ﲨع آوري گردیدند . زیست سنجی به روش تغیﲑ یافته مارآوئﲔ و ﳘکاران - - 2000 صورت گرفت.
نتایج
نتایج آزمایشات PCR نشان داد آه حدود 22 ایزوله - %31/4 - از 70 ایزوله مورد بررسی حاوي ژن هاي موثر بر ﳕاتد ها می باشند. بیشﱰین فراوانی ژنی مربوط به ژن cry6 با %24/2 فراوانی و به دنبال آن cry14 با %12/ 8 ، cry21 با %4/2 و cry5 با %2/8 به ترتیب قرار داشتند.
در این مطالعه درسویه هاي بومی پنج پروفیل متفاوت دیده شد آه در جدول ﴰاره 1 به تفکیک مشخص می باشند. هیچکدام از ایزوله ها با پراﳝر ژن cry13 باندي از خود نشان ندادند و 4 ایزوله 82 ،KH4 ،GON3 و GON7 نیز با این پراﳝر ها باند هاي آاملا غﲑ اختصاصی نشان دادند.
ایزوله هاي حاوي ژن هاي موثر بر ﳕاتد ها جهت بررسی هاي بیشﱰ و شناسایی الگوي پروتئیﲏ آهنا با 10 SDS-PAGEو 12 درصد مورد ارزیابی قرار گرفتند. این ایزوله ها باند هاي پروتئیﲏ بﲔ 18 تا 135 آیلودالﱳ از خود نشان دادند. شکل مورفولوژیک آریستال هاي
تولیدي توسط این ایزوله ها نیز با میکروسکوپ نوري و فاز آنﱰاست مورد ارزیابی قرار گرفت. سویه هاي مذآور اشکال دوآی، میله اي، مستطیلی وگرد را در خود نشان دادند.
در تست آشندگی مرحله اول اثر این توآسﲔ ها بر روي ﳕاتد هاي aphelenchus avenae و cephalobus persegnis مورد ارزیابی قرار گرفتند. دو ایزوله s17 و s2 در دز 15میکروگرم بر میلی لیﱰ ﳏیط رشد بیشﱰین آشندگی را بر علیه aphelenchus avenae به خود اختصاص دادند . ایزوله s2 در دز 25 میکروگرم بر میلی لیﱰ بیشﱰین آشندگی رابر علیه cephalobus persegnis به خود اختصاص دادند.
جدول : 1 ایزوله هاي حاوي ژن هاي موثر بر ﳕاتد ها
ﲝث
ترآیبات ژنی بدست آمده در این ﲢقیق براي اولﲔ بار در دنیا گزارش گردیده و نقطه قوت این مطالعه این می باشد. در هیچ یک از مطالعات قبلی این تعداد ژن و این نوع ترآیب ژنی دیده نشده اند
برخی شویه هاي براي پراﳝرهاي اختصاصی ژن هاي موقر بر ﳕاتود، باند هاي غﲑ اختصاصی نشان دادند آه احتمالا ژن هاي جدیدي باشند لذا نیاز به مطالعات بعدي می باشند آه در حال حاضر مطالعات تکمیلی در جریان می باشد. در مورد اینکه باند هاي پروتئیﲏ متفاوت در بﲔ سویه ها دیده شد علت این می تواند باشد آه این ایزوله ها حاوي ژن هاي دیگري نیز می باشند آه در مطالعات قبلی به آهنا اشاره شده است
در حال حاضر باند هاي پروتئیﲏ موثر بر ﳕاتدها مشخص نشده است لذا نیاز می باشد آه این ژن ها بطور آامل آلون شده و ﳏصول پروتئیﲏ آهنا در E.coli بررسی گردد. در مورد شکل مورفولوژیک نیز هنوز اشکال دقیق موثر بر ﳕاتد شناسایی نشده است و فقط می توان به ذآر این نکته اآتفا آرد آه ایزوله s2 آه آشندگی بیشﱰي نشان داد حاوي آریستال هاي مستطیلی، گرد و بیضوي می باشد. این ایزوله تنها حاوي ژن cry5 می باشد آه بر اساس مطالعات قبلی این ژن بیشﱰین آشندگی را به خود اختصاص داده است
