بخشی از مقاله
چکیده
پاتوتایپهای انتروتوکسیژنیک و مهاجم رودهای اشریشیاکلی از عوامل بالقوه بیماری اسهال در گوسالهها به شمار میروند که باعث مشکلات و خ سارات اقت صادی قابل توجه دامداری ها میگردد. هدف اصلی این تحقیق، شنا سایی ژنهای حدت در پاتوتیپهای انتروتوک سیژنیک و مهاجم رودهای اشریشیاکلی جدا شده از مدفوع گوسالههای اسهالی در دامداریهای اطراف کرمان و تعیین گروهها و تحت گروههای فیلوژنی پاتوتیپهای ذکر شده میباشد.
تعداد 133 سوآب مدفوع گوساله اسهالی زیر یک ماه از گاوداریهای اطراف شهرستان کرمان اخذ شد و پس از تایید بیوشیمیایی جدایههای اشریشیاکلی، مورد بررسی مولکولی قرار گرفت. ژنهای حدت ipaH، LT، ST و K99 - F5 - جهت شناسایی پاتوتیپهای انتروتوکسیژنیک و مهاجم روده ای مورد بررسی قرار گرفت. همچنین زمینه فیلوژنتیکی ECOR جدایهها تعیین شد. بر اساس نتایج آزمایش مولتی پلکس PCR، دو جدایه 1/5 - درصد - واجد ژن ST بوده که یکی از جدایه ها در گروه فیلوژنی A - تحت گروه - A0 و جدایه دیگر در گروه فیلوژنی B1 قرار داشت.
6 جدایه 4/5 - درصد - هم واجد ژن K99 بودند که در گروه های مختلف فیلوژنی انتشار داشتند. از بین جدایه های مورد بررسی، یک جدایه 0/75 - درصد - واجد ژن ipaH بود که این جدایه در گروه فیلوژنی B1 قرار داشت. با توجه به فراوانی کم ژن های حدت در موارد اسهال گوساله ها، به نظر می رسد علاوه بر پاتوتیپهای دیگر اشریشیاکلی نظیر انتروپاتوژنیک و نکروتوکسیژنیک، سایر باکتری ها و عوامل عفونی از قبیل عوامل ویروسی و انگلی در بروز سندرم اسهال در گاوداری های منطقه کرمان نقش دارد.
-1 مقدمه
به طور کلی در هنگام تولد، باکتری اشریشیاکلی در همه پستانداران و پرندگان خونگرم، کلونیزه و بخشی دائمی از فلور طبیعی دستگاه گوارش می شود. با این حال، برخی از سویه های اشریشیاکلی با بیماری های دستگاه ادراری و تناسلی، اسهال و استفراغ، سپتی سمی و عفونت های پلورال در انسان و حیوانات در ارتباط می باشند .[1]
پتانسیل بیماری زایی در باکتری اشریشیاکلی از طریق مکانیسم های مختلفی تعیین می شود که بیان ژن های حدت و نوع آ سیب زایی از مهمترین آن ها ا ست 3]،..[2 بر این ا ساس می توان سویه های بیماری زایا شری شیاکلی را به دو گروه عمدهی سویه های ایجادکنندهی بیماری های روده ای و سویه های ایجادکنندهی بیماری های خارج روده ای طبقه بندی کرد.
سویه های ایجادکنندهی بیماری های روده ای حداقل به شش پاتوتیپ، قابل تقسیم بندی هستند 4]،..[2 در میان این گونه ها، اشریشیاکلی انتروتوکسیژنیک - ETEC - و اشریشیاکلی مهاجم روده ای - EIEC - از عوامل بالقوه بیماری اسهال در گوسالهها به شمار میروند که باعث بیماری و مشکلات اقتصادی قابل توجهی در دامداریها میگردند .[5]
مهمترین عامل ایجاد کنندهی اسهال گوساله ها سویه های ETEC هستند .[6] اسهال ایجاد شده توسط اشریشیاکلی که کلی با سیلوز نامیده می شود، در سن5 -3 روزگی متداول ا ست. هر چند ممکن ا ست در یک روزگی و به ندرت تا سه هفتگی اتفاق افتد. سویه های اشریشیاکلی مهاجم روده ای می توانند هم اسهال آبکی و هم اسهال خونی که شبیه دیسانتری می باشد ایجاد نمایند 9]،8،.[7 شیوع EIEC معمولا همراه با آب یا غذای آلوده با مدفوع انسان یا انتقال شخص به شخص است.
مطالعات زیادی، ارتباط بین گروه های فیلوژنی و پاتوژنسیتی اشریشیاکلی را نشان داده اند. لذا با توجه به متفاوت بودن فاکتور های دخیل در بیماری زایی اشریشیاکلی در مناطق مختلف دنیا مطالعه فیلوژنی و عوامل مرتبط با بیماری زایی در باکتری های جدا شده ضروری به نظر می رسد. یکی از پرکاربردترین روش های بررسی فیلوژنتیک در حال حاضر، تعیین توالی مولتی لوکوس - MLST - می با شد.
بر ا ساس این روش، گروه بندی فیلوژنتیک شامل گروه A، B1، B2، D و همچنین تحت گروه های A0، A1، B1، B22، B23، D1 و D2 می باشد .[11] با توجه به مطالب فوق، هدف اصلی در این تحقیق، شناسایی ژن های حدت در پاتوتیپ های انتروتوکسیژنیک اشریشیاکلی - ژن های ST، LT و - K99 و اشریشیاکلی مهاجم روده ای - ژن - ipaH در فیلوتایپ های اشریشیاکلی جدا شده از مدفوع گوساله های اسهالی در دامداریهای اطراف کرمان می باشد.
-2 مواد و روش ها
-2-1 جمع آوری و انتقال نمونه به آزمایشگاه در این مطالعه تعداد 133 سوآب مدفوع گوساله اسهالی زیر یک ماه از گاوداری های اطراف شهرستان کرمان اخذ شد. به منظور جدا سازی و شنا سایی فنوتیپی باکتریا شری شیاکلی، نمونهها در محیطهای انتخابی و افتراقی ک شت داده شدند و به منظور تایید نهایی پرگنههای مشکوک، از محیط های TSI، SIM، MRVP استفاده گردید .[12] پس از تایید، استخراج DNA به کمک روش NaOH بر روی یک پرگنه از کشت تازه در محیط LB آگار صورت پذیرفت.
-2-2 شناسایی سویه های ETEC و EIEC
برای شناسایی سویه های ETEC و EIEC از توالی پرایمرهای معرفی شده در مطالعهی آراندا و همکاران در سال 2004 به صورت مولتی پلکیس PCR - جدول - 1 استفاده شد .[13] برنامهی دمایی عبارت بود از: °95C برای 5 دقیقه، 35 سیکل شامل °95C برای 45 ثانیه، °49C برای 45 ثانیه و °72C برای 45 ثانیه، پس از اتمام سیکل ها °72C برای 7 دقیقه و در نهایت محصولات PCR الکتروفورز گردیدند.
-2-2 تعیین گروه فیلوژنتیکی برای تعیین گروه های فیلوژنتیکی، جدایه ها توسط پرایمر های معرفی شده در مطالعهی کلرمونت و همکاران در سال 2000 به و سیلهی مولتی پلکس PCR - جدول - 2 مورد آزمایش قرار گرفتند .[14] برنامهی دمایی عبارت بود از: °94C برای 5 دقیقه، 29 سیکل شامل °94C برای 30 ثانیه، °55C برای 30 ثانیه و °72C برای 30 ثانیه، پس از اتمام سیکل ها °72C برای 7 دقیقه. در نهایت محصولات PCR الکتروفورز گردیدند.
