بخشی از مقاله
چکیده
مطالعات تاکسونومیکی جنس Padina - Dictyotales, Phaeophyceae - ، از سواحل خلیج فارس بر اساس آنالیزهای ملکولی و مورفولوژیکی با استفاده از ژن rbcL صورت پذیرفت. در مطالعه ریختشناسی، چندین صفت نظیر میزان رسوب-گذاری بر روی دو سطح بالایی و پایینی پیکرهی گیاه، موقعیت اسپورانژیاها، حضور و عدم حضور آندوزیوم، موقعیت خطوط موئی بر روی هر دو سطح و نیز نسبت به اسپورانژیاها، مورد بررسی قرار گرفت.
در بین گونههای مورد مطالعه، گونههای P. distromatica، P.boryana، P.gymnospora، P. boergessenii و P.pavonica مورد ارزیابی مجدد قرار گرفتند. با استفاده از دادههای ملکولی و مورفولوژیکی، گونه Padina sp.FA ، تفاوت-های مورفولوژیکی با P. australis نشان داد و توالی های جدیدی در آنالیز ملکولی از آن بدست آمد. نمونه Padina sp.PG نیز تفاوتهای مورفولوژیکی با P. antillarum نشان داد و توالی جدید ژنی برای آن ارائه شد.
مقدمه
جنس Padina Adanson، بعد از 76 - Dictyota گونه - با داشتن 43 گونه بیشترین تعداد از گونهها را در خانواده Dictyotaceae در برمیگیرد . - Guiry and Guiry 2012, Ni-Ni-Win et al., 2008, 2010, 2011a - تا قبل از شناسایی Newhousia imbricata , - Kraft et al., 2004 - ، Padina تنها جنس واجد رسوبات کلسیمی بود. این رسوبات در سطوح دیواره سلولی قرار میگیرند.
این صفت به همراه صفت بادبزنی بودن برگها ویژگیهایی هستند که به راحتی میتوان این جلبک را در طبیعت تشخیص داد، ولی تشخیص گونههای آن از همدیگر به راحتی میسر نیست و نیاز به مطالعه چرخه تولید مثلی و خصوصیات مورفولوژیکی نظیر محل و میزان کالسیفیکاسیون، تعداد لایههای سلولی، محل و موقعیت خطوط موئی نسبت به تتراسپورانژها و همچنین طبیعت تک پایه یا دو پایه بودن گامتوفیتهای آنها دارد. جنس Padina دارای چرخه زندگی Diplohaplontic isomorphic، با یک تناوب نسل از گامتوفیتهای هاپلوئید و اسپوروفیتهای دیپلوئید است. در این چرخه هر دو نسل هاپلوئید و دیپلوئید، نسلهای پر سلولی حقیقی هستند و گامتوفیت و اسپوروفیت از لحاظ مورفولوژیکی،کاملاً مشابه هستند.
استفاده از مطالعات ملکولی به همراه مطالعات مورفولوژیکی، میتواند برای شناسایی دقیق موجودات مورد استفاده قرار گیرد. معمولترین توالی برای تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک جلبکها، ژن کد کننده زیر واحد بزرگ آنزیم RuBisCO، ریبولوز 1، 5 دی فسفات کربوکسیلاز/ اکسیژناز است که تثبیت CO2 اولیه را در چرخه کلوین تسهیل میکند. این آنزیم دارای ساختار چهار واحدی است و دربردارنده 8 زیر واحد کوچک و 8 بخش بزرگ است.
ژن rbcL قادر به نشان دادن صفات زیادی است که برای آنالیزهای فیلوژنتیکی بسیار مفید میباشند. همچنین نسبت تکاملی آرام این ژن باعث میشود تا ارتباطات بین سطوح خانواده و یا بالاتر را بخوبی نشان دهد. توانایی در حفاظت پرایمرها در این ژن باعث تکثیر سریع و توالی شدن آن میشود. توالییابی با استفاده از ژن rbcL، در بیشتر مطالعات استفاده شده است - Ni-Ni-Win et al., 2011b , Silberfeld et al., . - 2013 در پروژه حاضر با استفاده از مارکر rbcL، روابط فیلوژنی بر روی گونههای جنس Padina صورت پذیرفته و توالیهای جدیدی ثبت گردید.
مواد و روشها
جمعآوری نمونهها از سواحل قشم 26 28' N 54œ 78' E شامل ایستگاههای نمکدان، شیب دراز، جزایر ناز، پشت فرمانداری سابق، مسن ماسهای و مسن صخرهای، سوزا در تیر ماه، آذر ماه و اسفند ماه 1389 صورت گرفت. جمعآوری نمونه-ها، در زمان جزر کامل - حدود 17 متر دور از ساحل - صورت گرفت و در برخی مناطق مثل شیب دراز با شروع جزر کامل و آشکار شدن حوضچههای صخرهای، جلبکها از این حوضچهها جمعآوری گردید.
بعد از جمعآوری نمونههای جلبکی، تعدادی، با فرمالین 5 درصد تثبیت شدند. این نمونهها برای تهیه لام از طریق میکروتوم و همچنین مطالعات ظاهری نمونه در دو سطح بیرونی و درونی استفاده شد. علاوه بر این برخی از نمونههای نگهداری شده در فرمالین، در هرباریوم دانشکده علوم زیستی دانشگاه شهید بهشتی قرار گرفتند. شیوه نمونهبرداری و مراحل مختلف آن از طریق دستورالعمل , - Tsuda, 1985 , Abbott 2003, Geraldino et al., 2005 - صورت گرفت.
تعدادی نیز بلافاصله به ظروف پلی اتیلنی حاوی سیلیکاژل انتقال یافتند. این عمل جهت آبگیری سریع و جلوگیری از تخریب DNA انجام شد. دستورالعمل بکار رفته در برداشت، تثبیت و آمادهسازی نمونهها جهت استخراج DNA بر طبق دستورالعملهای - Siemer et al., 1998, Ni-Ni-Win et al., 2008 - صورت گرفت. بعد از انجام مراحل PCR بر اساس دستورالعمل - Ni-Ni-Win et al. , 2008 and 2011b - ، نتایج تعیین توالیهای همولوگ از طریق برنامههای - Bio Edit - Hall , 1999 و MEGA5.1 صورت پذیرفت. جهت تعیین همولوژی توالی در پایگاه NCBI ابزار NCBI BLAST مورد استفاده قرار گرفت.
سپس با سایر توالیهای موجود در پایگاه مقایسه و با کمک آنها جلبکها شناسایی شدند. مراحل همتراز کردن توالیها از طریق دستورالعمل - Thompson et al.,1994 - انجام گرفت. به منظور بررسی فیلوژنی گونهها و رسم درخت فیلوژنی از آنالیزهای ماکزیمم پارسیمونی، ML و NJ، از طریق برنامه MEGA5.1 استفاده شد . - Tamura et al., 2011 - مناسبترین مدل تکاملی جهت آنالیزهای - ML - از طریق انتخاب بهترین مدل بر اساس معیار ارزشها در برنامه MEGA5.1 انجام شد. آنالیزهای فنتیکی از طریق برنامه PAST که توسط Hammer و همکاران در سال 2009 طراحی شده، صورت پذیرفت.
نتایج و بحث
در این تحقیق، آنالیزهای فیلوژنی با استفاده از ژن rbcL، به همراه ویژگیهای مورفولوژیکی، منجر به شناسایی دو گونه Padina sp. FA و Padina sp.PG ،در سواحل خلیج فارس شد که قبلاً گزارش نشده بود. از لحاظ مورفولوژیکی Padina sp.PG بسیار نزدیک به نمونه Padina antillarum - P. tetrastromatica - شناسایی شده توسط Wynne در سال 1999 بود. اختلاف بین دو نمونه خلیح فارس و نمونه Padina antillarum - P. tetrastromatica - در میزان رسوبگذاری بر روی پهنک- ها و تعداد لایههای سلولی در آنها است. گونه Padina sp.PG مشابه با Padina antillarum - Kützing - Piccone = P. tetrastromatica Hauck است ولی پهنکهای Padina antillarum - Kützing - Piccone = P. tetrastromatica Hauck فاقد رسوبگذاری است .
- Wynne et al., 1999 - همچنین در برشهای عرضی در بخشهای میانی و تحتانی پهنکها ، 4 لایه سلول دیده میشود اما در گونه خلیج فارس در تمام بخشها دو لایه سلول ولی در بخشهای تحتانی 4 لایه سلول دیده می شود. درختچه فیلوژنی نیز با بوت ستراپ 92 درصد جدائی Padina sp.PG را از Padina antillarum= P. tetrastromatica Hauck نشان میدهد - شکل . - 2 آنالیزهای ملکولی در مطالعات نشان میدهند که گونههای چند لایهای، تک نیا هستند. اما گونههای 2 لایهای و 4-2 لایهای چند نیایی هستند. بنابراین لایههای سلول یک مشخصه مهم در فیلوژنی محسوب میشود.
با توجه به اینکه اغلب اعضای جنس Padina، دارای پیکرهی دو لایهای هستند و خیلی سریع در درختچه فیلوژنی منشعب میشوند، بنظر میآید که پیکرهی دو لایهای یک صفت نیایی یا ابتدایی در جنس Padina است. پیکرهی گیاهبا داشتن بیش از دو لایه سلول احتمالاً حالت اشتقاق یافتهای از تالس دو لایهای است Ni-Ni-Win et al., . - 2013 - از لحاظ میزان فراوانی نمونهها، گونههای Padina australis و Padina sp.FA در منطقه بیش از دیگر گونهها است. این دو نمونه از لحاظ مورفولوژیکی بسیار به هم شبیه هستند ولی اختلافات نوکلئوتیدی بیش از ده نوکلئوتید در دادههای ملکولی، آنها را از هم جدا میکند.
Padina sp. FA ارتباط نزدیکی با Padina australis و Padina boergesenii دارد. در مطالعات ملکولی، گونههایP. boergessenii جمعآوری شده از تانزانیا و هاپلوتایپهای Padina sp. FAکاملاً به هم نزدیک هستند. این گونهها با هم در یک گروه قرار میگیرند. بنظر میآید که بهتر است گونههای Padina sp. FA و گونههای P. boergessenii را به دلیل داشتن توالیهایی با اختلافات نوکلئوتیدی بسیار کم، به عنوان نمونههای conspecific - دو گونهای که از لحاظ تشریحی با هم تفاوت دارند، ولی در دادههای ملکولی مشابه هستند و به عنوان اعضای یک گونه در نظر گرفته میشوند - در نظر گرفت.
ولی برای روشن شدن این موضوع که آیا این دو گونه یکی هستند و یا گونه خلیج فارس، صد در صد گونه جدیدی است، نیاز به مطالعه بر روی تعداد نمونههای بیشتر و با استفاده از ژنهای دیگر است. ولی بهتر است که تا آن زمان این را به عنوان یک گونه جدید در نظر گرفت. گونه Padina sp. INDGRO32 haplotype 3 مشابه با Padin sp. PG haplotype1 دارای رسوبگذاری به میزان کمی در هر دو سطح است. این دو از لحاظ ملکولی در یک دسته ولی جدا از هم قرار میگیرند Padina sp. INDGRO32 haplotype: 3 به عنوان هاپلوتایپی از Padina antillarum - Kützing - Piccone = P. tetrastromatica Hauckمعرفی میشود . این مطالعه اهمیت تاکسونومی ویژگیهای دیگر را برای جدایی گونهها نشان می-دهد.
برای مثال گونه Padina boryana از لحاظ مورفولوژیکی بسیار مشابه با P. australis Hauck است و به سختی میتوان این دو را از هم تشخیص داد. آنها با دو مشخصه از هم جدا میشوند، در P. australis Hauck اسپورانژها و خطوط موئی در هر دو سطح دیده میشوند ولی در Padina boryana در یک سطح دیده میشوند. همچنین ضخامت سلولی در همه بخشهای پیکره P. australis Hauck دو لایهای ولی در قاعده Padina boryana ، 3 لایه سلول ضخامت دارد. تمایز آنها در دادههای فنتیکی - شکل - 1 نیز به خوبی نشان داده شده است.
در نمونههای جمعآوری شده بیشتر تتراسپوروفیت دیده شد. ویژگیهای جدایی گونههای جنس Padina تعداد لایههای سلولی رنگ تالس آندوزیوم، خطوط موئی، ترتیب خطوط موئی با اسپورانژیوم، سورهای اسپورانژیالی، میزان رسوبگذاری بر روی هر دوسطح پایه - Stip - ، پایه همراه با موهای فیبروس رنگی و تعداد پهنکها میباشد.
