بخشی از مقاله
چکیده:
به منظور شناسایی نشانگرهاي مثبت مرتبط با برخی خصوصیات فیزیکی دانه در ژنوتیپهاي آفتابگردان با استفاده از نشانگرهاي SSR و TRAP از 21 نشانگر SSR و 19 نشانگر TRAP در 68 ژنوتیپ آفتابگردان استفاده شد. تمام نشانگرهاي مورد استفاده چندشکل بودند.
براي شناسایی نشانگرهاي مثبت مرتبط و پیوسته با برخی از مهمترین خصوصیات فیزیکی دانه - طول دانه، عرض دانه، ضخامت دانه و وزن هزاردانه - ، از تجزیه رگرسیون گام به گام با در نظر گرفتن مکانهاي نشانگري به عنوان متغیرهاي مستقل و صفات فیزیکی دانه به عنوان متغیرهاي وابسته استفاده شد.
نتایج نشان داد که بیشترین آغازگر مثبت براي صفت طول دانه توسط نشانگر 3 - SSR نشانگر - و ضخامت دانه توسط نشانگر 5 - TRAP نشانگر - شناسایی شد. آغازگر Ha 494-ar نشانگر SSR و آغازگرهاي MAX3BR- Ga5 نشانگر TRAP در تمام صفات یکسان بودند. شناسایی نشانگرهاي مثبت پیوسته با صفات مختلف در آفتابگردان میتواند در انتخاب به کمک نشانگرهاي مولکولی در برنامههاي اصلاح آفتابگردان مفید و موثر واقع شود.
مقدمه
آفتابگردان - Helianthus annuus L. - با سطح زیرکشت حدود 26 میلیون هکتار و تولیددانه 47 میلیون تن سالیانه از مهمترین گیاهان روغنی جهان بهشمار میرود. ایران با مصرف روغن حدود 900 هزار تن در سال، 90 درصد روغن موردنیاز خود را با واردات تامین میکند. در سال 2016 میزان سطح زیر کشت آفتابگردان در ایران حدود 41 هزار هکتار و میزان تولید دانه حدود 40 هزار تن بوده است
در حال حاضر برنامههاي اصلاح آفتابگردان سه هدف عمده افزایش عملکرد، ایجاد پایداري عملکرد دانه و روغن و یافتن منابع جدید نرعقیمی سیتوپلاسمی را دنبال میکنند. کاهش طول دوره رویشی، افزایش عملکرد و ایجاد یکنواختی از طریق تهیه هیبریدهاي یکجانبه و سهجانبه از مهمترین اهداف اصلاح آفتابگردان در کشور ما بهشمار میرود .
نشانگرهاي مولکولی که کاربرد آنها در اصلاح آفتابگردان روز به روز بیشتر می شود از نظر صرفهجویی در هزینه و زمان بسیار مفید میباشند. برنامههاي اصلاح آفتابگردان در ایران تاکنون بیشتر بر روي روشهاي کلاسیک استوار بوده است اما در سالهاي اخیر گزارشهاي مختلفی توسط پژوهشگران درباره کاربرد نشانگرهاي مولکولی از جمله TRAP، SSR، ISSR، IRAP و REMAP در ارزیابی تنوع ژنتیکی و شناسایی مکانهاي صفات کمی در آفتابگردان منتشر شدهاند.
تعیین ارتباط بین نشانگرهاي مولکولی و صفات مختلف، میتواند گامی موثر در استفاده از انتخاب به کمک نشانگر باشد. پیوستگی ژنتیکی بین نشانگرها و مکانهاي ژنی صفات کمی، محتملترین توجیه براي وجود رابطه بین نشانگرهاي مولکولی و نمود صفات کمی است. از طرفی، وزن هزاردانه یکی از مهمترین اجزاي عملکرد و صفات اصلاحی و بهنژادي در آفتابگردان بشمار میرود. هدف از پژوهش حاضر، شناسایی نشانگرهاي مثبت مرتبط با برخی خصوصیات فیزیکی دانه در ژنوتیپهاي آفتابگردان با استفاده از نشانگرهاي SSR و TRAP بود.
مواد و روشها
مواد گیاهی
68 ژنوتیپ مورد بررسی در این آزمایش همگی از بخش تحقیقات دانههاي روغنی مرکز تحقیقات کشاورزي و منابع طبیعی آذربایجان غربی – ایستگاه تحقیقات کشاورزي و منابع طبیعی خوي تهیه شدند. این ژنوتیپها شامل 23 لاین پدري برگرداننده باروري، 30 لاین مادري نرعقیم باروري - این 53 لاین در سالهاي اخیر به عنوان مواد ژنتیکی گیاهی در برنامههاي اصلاح ژنتیکی و تولید هیبریدهاي جدید آفتابگردان مورد استفاده قرار گرفتهاند - ، 8 هیبرید تجاري خارجی، 3 هیبرید ایرانی و 4 رقم تجاري آزاد گرده افشان خارجی بودند. صفات فیزیکی دانه در آزمایشگاه از طریق 3 نمونه 10 تایی اندازهگیري شدند. صفات طول دانه، عرض دانه و ضخامت دانه با کولیس به صورت میلیمتر اندازهگیري شدند و وزن هزاردانه با ترازوي حساس به صورت گرم اندازهگیري شد.
استخراج DNA
بعد از اندازهگیري صفات فیزیکی، از هر ژنوتیپ تعداد 10 گیاه در شرایط گلخانه کشت شدند. نمونههاي برگی از برگهاي جوان 20-15 روزه به صورت بالک صورت گرفته و قبل از استخراج در فریزر -80 درجه سانتیگراد نگهداري شدند. استخراج DNA ژنومی به روش بهینهسازي شده زینلزاده تبریزي و همکاران - ZeinalzadehTabrizi, et al. 2015 - براي گیاه آفتابگردان استخراج شده و در مقدار 150 µl بافر - Tris 10mM, EDTA 1mM; TE; pH 8.0 - TE حل شد. کمیت و کیفیت DNAهاي ژنومی استخراجی با استفاده از نسبت A260/A280≈1.8 براي آلودگی پروتئینی و نسبت A260/A230≈2 براي ترکیبات فنلی و پلی ساکاریدي با استفاده از طول موج دستگاه اسپکتروفتومتر ND-3300 spectrophotometer - NanoDrop Technologies, USA - اندازهگیري شد. علاوه بر این، کیفیت DNAهاي ژنومی استخراجی با استفاده الکتروفورز ژل آگارز 0/8 درصد در بافر 1X SB به مدت 30 دقیقه انجام شد. اندك نمونههاي داراي اسمیر حذف و استخراج دوباره براي آنها انجام شد.
انتخاب آغازگرهاي TRAP
براي شناسایی نشانگرهاي مثبت، آغازگرهاي TRAP مورد استفاده در این پژوهش شامل 6 آغازگر ثابت و 6 آغازگر تصادفی بود. از 19 ترکیب آغازگري براي ایجاد نشانگر TRAP استفاده شد. واکنشهاي زنجیرهاي پلیمراز با استفاده از دستگاه ترموسایکلر 96 تایی MultiGene Gradient Thermal Cycler - TC9600-G-230V, Labnet International, Inc. - در حجم نهایی 20μL شامل DNA 1μL ژنومی با مقدار 50-30 ng/μL، 2μL بافر 10X PCR، 1μL منیزیم کلراید 25 mM MgCl2، 0/5μL از 10 mM dNTP، 100 pmol 0/5μL از هر آغازگر و 1/5 واحد آنزیم تک پلیمراز انجام شد. چرخههاي دمایی در برنامه touch down PCR به صورت زیر انجام شد: براي واسرشتسازي 1 DNA چرخه در دماي 94°C به مدت 2 دقیقه، 5 چرخه شامل 94°C به مدت 45 ثانیه، 35°C به مدت 45 ثانیه و 72°C به مدت 1 دقیقه بود. سپس 35 چرخه بعدي شامل 94°C به مدت 45 ثانیه، 50°C به مدت 45 ثانیه و 72°C به مدت 1 دقیقه بود. دماي اتصال براي همه ترکیبات آغازگري ثابت بود.
انتخاب آغازگرهاي SSR
براي شناسایی نشانگرهاي مثبت در ژنوتیپهاي مورد بررسی از 21 نشانگر SSR استفاده شد. واکنشهاي زنجیرهاي پلیمراز با استفاده از دستگاه ترموسایکلر 96 تایی MultiGene Gradient Thermal Cycler - TC9600-G-230V, Labnet International, Inc. - در حجم نهایی 20μL شامل DNA 1μL ژنومی با مقدار 50-30 ng/μL، 2μL بافر 10X PCR، 1μL منیزیم کلراید 25 mM MgCl2، 0/5μL از 10 mM dNTP، 100 pmol 0/5μL از هر آغازگر و 1 واحد آنزیم تک پلیمراز انجام شد. چرخههاي دمایی به صورت زیر انجام شد: براي واسرشتسازي 1 DNA چرخه در دماي 96°Cبه مدت 2 دقیقه، سپس 30 چرخه بعدي شامل 96°C به مدت 30 ثانیه، 50-60°C به مدت 45 ثانیه و 72°C به مدت 1 دقیقه بود. همچنین در 72°C به مدت 15 دقیقه براي مرحله نهایی بود. دماي اتصال براي هر نشانگر SSR متفاوت بود.
آنالیز دادهها
باندهاي حاصل از 19 نشانگر TRAP و 21 نشانگر SSR به صورت 0 - عدم حضور - و 1 - حضور - نمرهدهی شدند. براي شناسایی نشانگرهاي مثبت مرتبط و پیوسته با برخی از مهمترین خصوصیات فیزیکی دانه - طول دانه، عرض دانه، ضخامت دانه و وزن هزاردانه - ، از تجزیه رگرسیون گام به گام با در نظر گرفتن مکانهاي نشانگري به عنوان متغیرهاي مستقل و صفات فیزیکی دانه به عنوان متغیرهاي وابسته استفاده شد. تجزیه آماري با استفاده از نرمافزار SPSS نسخه 24 انجام یافت.
نتایج و بحث
در این آزمایش براي تعیین ارتباط بین صفات فیزیکی دانه ژنوتیپ هاي آفتابگردان مورد مطالعه با دادههاي مولکولی و شناسایی نشانگرهاي SSR و TRAP مرتبط با این صفات، از روش رگرسیون گام به گام استفاده شد. در این حالت براي هر صفت به طور جداگانه رگرسیون مرحلهاي انجام شد. هر صفت کمی به عنوان متغیر وابسته و دادههاي مولکولی به عنوان متغیرهاي مستقل در نظر گرفته شدند و رگرسیون مرحلهاي محاسبه شد.
در این روش نخست اولین x - اولین نشانگر داراي بالاترین رابطه - بوده و ابتدا وارد مدل میشود و به همین ترتیب سایر متغیرها وارد مدل میشوند. نتایج نشان داد که بیشترین آغازگر مثبت براي صفت طول دانه توسط نشانگر 3 - SSR نشانگر - و ضخامت دانه توسط نشانگر 5 - TRAP نشانگر - شناسایی شد. آغازگر Ha 494-ar نشانگر SSR و آغازگرهاي MAX3BR- Ga5 نشانگر TRAP در تمام صفات یکسان بودند
در این آزمایش وجود مکانهاي مشترك براي صفات فیزیکی دانه آفتابگردان، احتمالا به دلیل پیوستگی و یا پلیوتروپی مکانهاي کروموزومی می باشد که وجود همبستگی معنیدار بین این صفات مورفولوژیک با همدیگر میتواند دلیلی بر این امر باشد. به عبارت دیگر ارتباط
نشانگرها با بیش از یک صفت بیانگر پیوستگی بسیار نزدیک این صفات با همدیگر و احتمالا تحت تاثیر بودن آنها توسط ژن هاي چنداثر میباشد. در این مطالعه نشانگرهاي Ha 494-ar SSR، Ha 806-ar، Ha 991-ar حدود 32 درصد تغییرات مربوط به صفت طول دانه و نشانگرهاي MSP03- Sa4 TRAP، F15O11F1- TRAP13 ، MAX3BR- Ga5 ، A11D14F- TRAP03 و B14G14B- Sa4 حدود 56 درصد از تغییرات صفت ضخامت دانه را توجیه کردند. احتمالا ژنهاي مربوط به این صفات، ژنهاي نزدیک به هم در مکانهاي کروموزومی باشند و ممکن است در فراهم آوردن اطلاعات اولیه در خصوص انتخاب غیر مستقیم صفات از طریق آغازگرهاي مرتبط مفید باشند. البته براي درك و اطمینان از وجود ارتباط پیوسته بین آغازگرها و صفات مختلف و همچنین شناسایی محل مکانهاي کنترلکننده این صفات بر روي کروموزومها نیاز به جمعیتهاي در حال تفکیک مثل F2، RIL و دابل هاپلویید میباشد
