بخشی از مقاله
چکیده
هدف از این پژوهش، شناسایی چند شکلی در جایگاه ژنی زیر واحد بتاي هورمون محرك فولیکول - FSHβ - در سه نژاد ایران بلک، آرمان و بلوچی بوده است. براي این منظور نمونههاي خون از 150 راس گوسفند از آن سه نژاد، واقع در ایستگاه عباس آباد مشهد جمع آوري و با حفظ زنجیره سرد به آزمایشگاه منتقل شد. دي ان اي هر یک از نمونهها به روش نمکی بهینه یافته استخراج و سپس با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی یک قطعه به طول 247 جفت باز از اگزون شماره دو این ژن به کمک واکنش زنجیره اي پلی مراز - PCR - تکثیر شد.
ردیابی چند شکلیها با استفاده از آنزیم ACCӀ و الکتروفورز محصولات حاصل از هضم آنزیمی روي ژل آگارز انجام گرفت. در نتایج حاصل از هضم آنزیمی چند شکلی در قطعه تکثیر شده مشاهده نشد و همه نمونهها در جایگاه مورد مطالعه براي نشانگر آنزیمی ACCӀ یک شکلی بودند. با توجه به ثبت رکورد دو و یا چند قلوزایی در هر سه جمعیت از سه نژاد مذکور، ادامه انجام تحقیقات به منظور شناسایی ژن هاي بزرگ اثر در دیگر بخشهاي این جایگاه ژنی و یا دیگر جایگاهها ضروري به نظر می رسد.
مقدمه
در صنعت پرورش گوسفند، کارآیی تولید به ازاي هر حیوان را میتوان با افزایش بازده تولید مثل از راههاي مختلفی، براي مثال، افزایش باروري، چند قلوزایی و کاهش طول چرخه تولید مثل - چند بارزایی - افزایش داد. یکی از هورمونهاي موثر بر فعالیت تولید مثلی هورمون محرك فولیکول - FSH - متعلق به خانواده گلیکوپروتئینهاي هترودایمري آلفا و بتا میباشد که زیر واحد بتا به این هورمون کارکرد فیزیولوژیک اختصاصی میدهد . - 4 -
هورمون محرك فولیکولی نوعی گیلیکو پروتیینی است که از هیپوفیز پیشین تراوش میشود و نقش مهمی را در تحریک رشد اندومترویوم، رشد و بلوغ فولیکول و تخمک ریزي دارد FSH. - 1 - در پستانداران داراي دو زیر واحد آلفا و بتا میباشد که ریز واحد آلفا در گونههاي یکسان، مشترك است و به طور کلی اثر بیولوژیک هورمون FSH به فعالیت اختصاصی زیر واحد بتا مربوط میشود. زیر واحد آلفا داراي سه اگزون و دو اینترون میباشد . - 8 -
وماك - 1987 - گزارش کرد که زیر واحد بتا در گاو روي کرومزوم شماره 15 قرار دارد و 6610 جفت باز طور دارد. غلظت این هورمون در خون با افزایش سن بیشتر میشود همچنین در دامهایی که نرخ زایش بیشتري دارند، غلظت FSH خون نسبت با سایرین بالاتر است . - 7 - لیانگ و همکاران - 2005 - از طریق مطالعه جهشهاي ژن FSHβ در خوك و گاو گزارش کردند که جایگاههاي چند شکل ژن FSHβ ممکن است ژنهاي بزرگ اثر1 کنترل کننده عملکرد تولید مثلی باشند یا پیوستگی ژنتیکی نزدیکی با ژنهاي عمدهاي داشته باشد . - 5 -
یکی از راههاي افزایش بره زایی - تعداد بره متولد شده در هر زایش - ، تشخیص و انتخاب میشهاي دو قلوزا میباشد که امروزه از طرق مختلف با آزمایش مولکول DNA امکان پذیر شده است. پژوهشهاي متعددي انجام شده که وجود چندین ژن بزرگ اثر موثر بر صفت دوقلوزایی را به اثبات رسانیده اند. لذا پژوهش به منظور یافتن ژنهاي بزرگ اثر موثر بر کارآیی تولید مثل، براي افزایش راندمان بره گیري در نژادهاي مختلف گوسفندان ایران نیز ضروري به نظر میرسد.
مواد و روش ها
در این تحقیق، از150 رأس میش نژاد آرمان، ایرانبلک و بلوچی متعلق به مرکز اصلاح نژاد دام شمال شرق کشور واقع در عباس آباد مشهد خونگیري به عمل آمد. به منظور استخراج DNA از روش نمکی بهینه یافته2 استفاده شد. سپس به منظور بررسی چندشکلی در اگزون 2 ژن FSHβ با استفاده از تکنیک ,PCR-RFLP یک قطعه به طول 247 جفت باز با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی تکثیر شد. توالی پرایمر شامل یک آغازگر رفت: F: ACTCAGGACTTGGTGTAC و یک پرایمر برگشت: R: CTGCTGCTCTTTATTCTC بوده است . - 4 -
واکنش زنجیره اي پلی مراز در حجم 18 میکرولیتر شامل ترکیبات با غلظتهاي، 7 میکرولیتر آب استریل دو بار تقطیر ، 8 میکرولیتر محلول MASTER KIT، /5 میکرولیتر از هر یک از آغازگرها 10 - پیکومول در هر میکرولیتر - ، 2 میکرولیتر DNA - با غلظت 50 نانوگرم - انجام گرفت پروتکل حرارتی شامل 5 دقیقه واسرشت سازي اولیه در 95 درجه سانتی گراد، 35 سیکل شامل واسرشت سازي در 94 درجه براي 30 ثانیه، اتصال آغازگرها در 49/5 به مدت 30 ثانیه، بسط در 72 درجه به مدت 45 ثانیه و بسط پایانی به مدت 10 دقیقه بوده است.
بعد از تکثیر از الکتروفورز ژل آگارز 1/5 درصد و رنگ آمیزي اتیدیوم برماید براي رویت سازي باندها استفاده شد. براي شنایایی چند شکلیهاي موجود، محصولات PCR تحت تیمار هضم آنزیمی ACCӀ با ترکیباتی شامل 0/2 میکرولیتر آنزیم، 1 میکرو لیتر بافر، 6/8 میکرولیتر آب مقطر دو بار تقطیر و 7 میکرو لیتر محصول PCR در دماي 37 درجه سانتیگراد به مدت 12 ساعت قرار گرفتند. نمونه ها بعد از تیمار آنزیمی، با الکتروفورز روي ژل آگارز 2 درصد و رنگ آمیزي اتیدیوم بروماید رویت سازي و تعیین ژنوتیپ شدند..
نتایج
رویت سازي باندها و استفاده از سایز مارکر نشان داد که قطعه 247 جفت بازي از اگزون 2 ژن FSHβ به طور اختصاصی تکثیر شده است. تیمار هضم آنزیمی محصولات به دست آمده در شکل 1 نشان داده شد. همان طوري که در شکل دیده می شود در اثر برش آنزیمی تنها یک فرم آللی - B - در همه نمونه ها مشاهده و در نتیجه همه نمونه هاي تعیین ژنوتیپ شده در هر سه نژاد ایران بلک، آرمان و بلوچی داراي ژنوتیپ مونومورف BB بودند.
بحث
در سال 2009 با مطالعه توالی نوکلئوتیدي و سطوح بیان ژن مرتبط با نرخ تخمک ریزي در بز سیاه یانلینگ که یک نژاد کم بارور چینی است و مقایسه آن با بز بوئر نشان داده شد که بز یانلینگ، فولیکول و اووسیت کمتري نسبت به بز بوئر داشت. همچنین مقدار بیان ژنهاي FSHR، FSHβ و BMP15 در یانلینگ کمتر، ولی بیان ژنهاي BMPR1B و ESR2 بیشتر بوده همچنین در بز یانلینگ FSH سرم کمتر ولی استروژن بیشتر بوده است.
تغییر در توالی و اختلاف در مقدار بیان پروتئین و mRNA ژنهاي مربوط به نرخ تخمک ریزي سبب باروري کم در بز سیاه یانلینگ شدهاست. مقدار کم FSHR و BMP15 سبب کاهش اووسیت و متعاقب آن کاهش تعداد فولیکولها شد . - 2 - زووا و همکارانش - 1999 - یک رتروپوزونی را در اینترون 1 ژن FSHβ یافتند که پس از مطالعات آماري مشخص شد ژنوتیپ BB به طور متوسط 2/53 خوکچه بیشتر در اولین زایش و 2/12 خوکچه زنده متولد شده بیشتري را دارا بودند . - 8 -
در سال 2010 با ردیابی چند شکلی در زیر واحد بتاي هورمون محرك فولیکول - FSHβ - و ارتباط آن با باروري زیاد در دو نژاد بز بوئر و بز شیري سانن زینونگ یک جایگاه ژنی چند شکلی در اگزون دو، با سه ژنوتیپ - EE , EF, FF - مشاهده کردند که به طور معنی داري با نرخ زایش رابطه داشته است و فراوانی آلل E و F در بز بوئر به ترتیب 0/75 و 0/25 و در بز سانن به ترتیب 0/78 و 0/22درصد بوده است . در بز شیري سانن ژنوتیپ EE به طور معنی داري نرخ زایش بیشتر در اولین تا چهارمین زایمان و متوسط زایمانها نسبت به دو ژنوتیپ EF و FF داشتند. بزهاي داراي ژنوتیپ EF نرخ زایش ببیشتر در دومین و میانگین زایمانها نسبت به ژنوتیپ FF داشتند.
