بخشی از مقاله
هدف: ازآنجاییکه تولید میکروبی ویتامین ب12 روشی بسیار ارزانتر از تولید شیمیایی آن است و تغییر شرایط فرآیند تولید تأثیر بسزایی در میزان راندمان و بهرهوري تولید دارد، در سالهاي متمادي طی پژوهشهاي مختلفی، ریزسازواره هاي متعدد، سامانه هاي کشت متفاوت و متغیرهاي عملیاتی مختلف مؤثر بر تولید میکروبی این ویتامین با ارزش مورد بررسی قرار گرفتهاند. در این مطالعه ضمن نیمنگاه به ساختار و شیمی ویتامین ب 12، تلاش بر این است تا کلیه پژوهشهاي انجام شده در زمینه میکروبی این ریزمغذي مرور شده و ضمن معرفی مؤثرترین متغیرهاي عملیاتی، روند تحقیقات در پژوهشهاي آینده در این زمینه ارائه شود.
مواد و روشها:مقاله مروري حاضر با استفاده از جستجوي الکترونیکی کلمههاي کلیدي ویتامین ب12، تولید میکروبی و عوامل مؤثر در بین 25 مقاله کامل انگلیسی ISI و مجلات زیستفناوري از ساال 1948 تا 2013 در رابطه با اثر عوامل مختلف بر تولید ویتامین ب12 انجام گردید. انتخاب مقالات بر اساس زمان برداشت دادهها و ارتباط موضوعی آنها با هدف این مقاله مروري انجام گردیده است. از متدولوژي و یافتههاي تمامی مقالات واجد شرایط استفاده شد.
نتایج و بحث: نتایج این بررسی نشان داد که از میان ریزسازوارههاي مختلف و متغیرهاي عملیاتی، بهترین باکتري مولد پروپیونیباکتریوم فرئودنریچیئی زیر گونه شرمانی بوده و موثرترین عوامل بر تولید ویتامین ب12 عبارتند از نوع سوبسترا، عصاره مخمر، بتائین، یون کبالت، 5و6 دي-متیل بنزیمیدازول، pH و دما می باشند. به نظر می رسد آینده تحقیقات به سمت استفاده از کشت ناپیوسته خواركدهیشده با سوبستراي ارزانقیمت ملاس و نیز تولید همزمان ویتامین ب12 و اسیدپرپیونیک در نوشیدنیهاي تخمیري صورت پذیرد. با این استراتژي هزینه استخراج ویتامین حذف خواهد شد.
نتیجهگیري کلی: کنترل شرایط عملیاتی در شرایط مطلوب بر بهرهدهی تولید ویتامین ب12 و قیمت تمام شده محصول نهایی موثر می باشد.
مقدمه:
ویتامین ب12 به گروهی از ترکیبات شامل کورینوئیدهاي کبالت گفته می شود که شاخصترین جزء آن کوبالامین است که در طبیعت -5دياکسی آدنوزیل کوبالامین - کوآنزیم ب - 12 و متیل آدنوزیل کوبالامین محصولات نهایی بیوسنتز ویتامین ب12 هستند، در حالی که ویتامین ب12 به فرم سیانوکوبالامین، به صورت صنعتی تولید میشود . - 1 - غلظتهاي پایین ویتامین ب12 در بافتهاي حیوانی نمی-تواند تأمینکننده نیاز روزانه باشد. از طرف دیگر با توجه به اینکه این ویتامین تولید شده توسط میکروارگانیسمهاي رودهاي در روده بزرگ جذب نمیشوند، انسانها ویتامین ب12 را از فقط طریق مواد غذایی به دست میآورند
نیاز متوسط روزانه به این ویتامین براي بزرگسالان حدود 3 ʽg در هر روز میباشد. سوء تغذیه در سطح ویتامین ب12 میتواند منجر به اختلالات فیزیولوژیکی شود که مهمترین آنها کمخونی میباشد. فقط 2 واکنش وابسته به ویتامین ب12 در انسانها تشخیص داده شده است که عبارتند از سنتز متیونین سنتتاز و متیل مالونیل COA موتاز . - 3 - این ویتامین کوفکتور بسیار مهمی براي متابولیسم کربوهیدراتها، چربیها، آمینواسیدها و اسیدهاي نوکلئیک است که در شیمی درمانی هم کاربرد دارد . - 4 - با توجه به هزینه بالا و پیچیدگی تولید شیمیایی این ویتامین به منظور تولید آن از روشهاي میکروبی استفاده میشود. از آنجاییکه عوامل مختلفی بر تولید این ریزمغذي مؤثراند، در این بررسی عوامل مؤثر بر تولید ویتامین ب12در پژوهشهایی که در طی سالهاي متمادي صورت پذیرفتهاند را ارائه مینماییم.
منبع کربنی
تاکنون منابع کربنی مختلفی اعم از آبپنیر - 5 - ، کفیر - 6 - ، ملاس - 7 - ، شکر - 7 - ، ملاس انورت شده - 7 - و حتی گلیسرول به عنوان محصول فرعی کارخانجات بیودیزل - 34 - براي تولید ویتامین ب12 به کار گرفته شدهاند. از میان ملاس، شکر و ملاس انورت شده، پروپیونیباکتریوم اسیديپروپیونیسی، ساکارز موجود در ملاس را سریعتر از مخلوط ساکارز، گلوکز و فروکتوز موجود در ملاس انورت شده مصرف میکند و در مقایسهاي که بین ملاس و شکر خانگی انجام شده است، ملاس منبع مناسبتري براي تولید ویتامین ب12
بوده است، چرا که ملاس یک منبع کمپلکس است
بیشترین میزان ویتامین ب12 تولیدي با استفاده از گلیسرول در بهترین شرایط 3/867 میلیگرم بر لیتر گزارش شده است
کاربرد مهندسی متابولیک در تولید ویتامین ب 12
به منظور افزایش بازدهی تولید ویتامین ب12 استفاده از مهندسی ژنتیک در تولید آن استفاده میشود. با استفاده از میکروارگانیسمهایی که با عوامل جهشزایی چون اشعه ماوراءبنفش یا مواد شیمیایی تیمار شدهاند و گونههاي با مزایاي کاربردي از جمله پایداري ژنتیکی، سرعت رشد بالا و مقاومت به حضور غلظت بالاي توکسینها کشت در محیط از بین آنها انتخاب گردیدهاند، ویتامین ب12 با بهرهدهی بالا تولید شده است . - 9 - پیشرفتهاي حاصل از بیولوژي مولکولی و همچنین بیوشیمی مولکولی، منجر به جداسازي تعدادي از آنزیمهاي مؤثر در سنتز ویتامین ب12 شد.
بهعلاوه مراحل بیوسنتز ویتامین ب12 در سودوموناس دنیتریفیکانس - 10 - و پروپیونیباکتریوم فرئودنریچییی - 11 - شناسایی شدهاند. ژنهاي بیوسنتزکننده ویتامین ب12 در بیشتر ائوباکترها و آرکهآ معلوم شدهاند . - 12 - بیستو دو ژن cob - پسوند cob به ژنهایی تعلق میگیرد که آنزمهاي مؤثر در بیوسنتز هوازي کوبالامین را کد میکنند - . - 13 - درگیر در بیوسنتز ویتامین ب12 جداسازي شدهاند اکثر کاربردهاي پلیپپتیدهاي کدشده با این ژنها شناسایی شدند
در سال 2004، پیائو و همکارانش تولید ویتامین ب12 را با استفاده از پروپیونیباکتریوم فرئودنریچییی که مهندسی ژنتیک روي آن انجام شده بود بررسی کردهاند. آنها بیان ژنهاي مختلفی را که در بیوسنتز ویتامین ب12 از دلتاآمینولوولونیکاسید را توضیح دادهاند. در این بررسی با استفاده از پروپیونیباکتریومفرئودنریچی که مهندسی ژنتیک شدهاند، مقدار ویتامین ب12 تولیدي افزایش پیدا کرد
بازدهی تولید ویتامین ب12 در مواردي که از گونههاي جهشیافته استفاده میشود میتواند به 300 میکروگرم در لیتر نیز میرسد که در مقایسه با مقادیر تولید شده در گونههاي طبیعی قابل مشاهده است
اکسیژن:
پروپیونیباکتریوم به عنوان باکتري مقاوم به اکسیژن شناخته شده است که قادر به رشد و تولید ATP در شرایط بیهوازي است. در-حالیکه بعضی از محققان گزارش کردهاند که این باکتري قادر به رشد در شرایطی است که اکسیژن کمی حضور دارد. باتوجه به اینکه پروپیونیباکتریوم میکروآئروفیل است، قادر است در غلظتهاي مختلفی از اکسیژن رشد کند. در تحقیقی که کوئسادا و همکارانش در سال 1998 روي باکتري پروپیونیباکتریوم شرمانی در سامانه ناپیوسته و با منبع کربنی گلوکز انجام دادند به این نتیجه رسیدند که با وجود افزایش میزان توده سلولی با هوادهی - از 7/9 تا18/3 گرم بر لیتر - ، میزان ویتامین ب12 با هوادهی از 3/1 به 0/5 میلیگرم بر لیتر کاهش مییابد
محیط کشت
عوامل مؤثر بر روي محیط کشت تولید ویتامین ب:12
کوئسادا و همکارانش در سال - 15 - 1994، عوامل مؤثر بر سنتز ویتامین ب 12 را با استفاده از پروپیونیباکتریوم اسیديپروپیونیسی در یک سیستم پیوسته مورد بررسی قرار داده و به نتایج زیر دست یافتند:
• 5 و 6 ديمتیلبنزیمیدازول: در طی آزمایشات مختلفی با شرایط متفاوت، نشان داده شده است که افزودن 5 و6 ديمتیل-بنزیمیدازول به عنوان پیشساز ویتامین ب12 براي افزایش کارایی متابولیکی محیط کشت کاربردي خواهد بود
• غلظت بالاي سوبسترا اثر ممانعت کنندگی بر رشد تعداد زیادي از میکروارگانیسمها دارد. با توجه به این که غلظت ساکارز بر رشد پروپیونیباکتریوم اسیديپروپیونیسی اثري ندارد، اثر غلظت ساکارز را روي تولید محصولات بررسی شده است. در مورد این گونه ،هیچ اثر ممانعت کنندگی با غلظت ساکارز در رنج30-170 گرم در لیتر دیده نشده است.
• تریپتون منبع اصلی نیتروژن به همراه مقدار کمی از مواد مغذي تقویت کننده رشد است.استفاده از مقادیر زیاد تریپتون خیلی هزینه بر است. با اضافه کردن مقدار مشابهی از عصاره مخمر می توان به مقدار بیشتري از غلظت سلولی و محصول دست یافت.لذا در محیط کشط مداوم می توان به جاي تریپتون از عصاره مخمر استفاده کرد. براي رشد اپتیمم محیط کشت مداوم پروپیونیباکتریوم اسیديپروپیونیسی براي دستیابی به مقدار بالایی از محصول، عصاره مخمر در غلظتهاي بالا مورد نیاز است.
ترکیبات موجود در عصاره مخمر ، تولید محصول را زیاد می کنند. این عصاره نمی تواند با ترکیبات مشخص شیمیایی در کشت مداوم جایگزین شود و حتماً باید به منظور دسترسی به مقدار اپتیمم محصول به محیط کشت اضافه گردد. غلظت عصاره مخمر لازم براي بهینه رشد سلولها وتشکیل محصول 12 گرم در لیتر است. در شدت رقیق سازي هاي بالا اثر عصاره مخمر قابل توجه نیست.
• بتائین - تريمتیلگلیسین - اثر فرعی در تأمین گروههاي متیل حلقه کورین در سنتز ویتامین ب 12دارد. حضور بتائین همچنین تولید آمینو لوولینلک اسید سنتتاز را هم تحریک میکند. غلظتهاي بالاي 2/8 گرم بتائین به ازاي هر گرم از وزن خشک سلولی در کشت مداوم، تولید ویتامین ب 12 را به طور قابل ملاحظه اي زیاد می کند.
• در تشکیل کوبالامین یون کبالت نقش مرکزي دارد.همین طور یون کبالت براي رشد پروپیونی باکترها لازم است. غلظت یون کبالت حدود ./75 میلیگرم کبالت به ازاي هر گرم از وزن خشک سلولی براي تشکیل بهینه مقدار اسیدپروپیونیک لازم است. لذا براي تشکیل ویتامین ب12 نمکهاي کبالت افزوده می شوند.
• کشتهاي P.acidipropionici به شدت به pH وابسته است.طبق مطالعات انجام شده، افزایش یک واحد در pH از 5/5 به6/5 مقدار اسید پروپیونیک تولیدي را دو برابر می کند. pH بهینه براي تولید ویتامین ب 12، 6/5-6/8 است.
• کشت مداوم P.acidipropionici نشان داد که این باکتري وابستگی غیر معمولی با دما دارد.افزایش دما از 25œc به35 œc، غلظت بیومس و محصول را زیاد می کند. افزایش دما تا 40 درجه سانتیگراد یا بیشتر منجر به افزایش سریع غلظت ویتامین ب 12و همین طور کاهش شدید غلظت سلولی می شود. شرایط پایا براي کشت مداوم P.acidipropionici بر قرار نمیشود.
• P.acidipropioniciمی تواند در شرایط کاملاًبی هوازي رشد کند ولی آئروتلرانت است.این نوع از پروپیونی باکتریوم قادر به تولید 5و6 ديمتیلبنزیمیدازول نمیباشد. تولید بهینه اسیدپروپیونیک در شرایط کامًلا بیهوازي صورت میگیرد درحالیکه ویتامین ب 12با هوادهی حدود 0/5vvm با 100rpm صورت می گیرد.
استفاده همزمان از لاکتوباسیلوس و پروپیونیباکتر براي تولید ویتامین ب12
لاکتوباسیلوس تولیدکننده خوبی براي فولات میباشد. پوشش کمبود ویتامین ب12 با فولات از طریق غنیسازي مواد غذایی با فولات، یکی از راهحلهاي درمان آنمی است. نسبت جرمی مناسب فولات به ویتامین ب12 براي مصرف انسان حدوداً 170 به 1 است و غنی-سازي همزمان مواد غذایی میتواند بسیار مؤثر باشد .
همچنین لاکتوباسیلوسها رشد پروپیونیباکترها را تحریک میکنند. به گونهاي که پروپیونیباکتر روي محیطی که قبلاً توسط لاکتوباسیلوس مورد استفاده قرار گرفته است به خوبی رشد میکند و ویتامین ب 12 نیز تولید میکند
