بخشی از مقاله
چکیده
باغات انار، امروزه از نطر درآمدزایی، اشتغال و تقاضای بالا برای صنایع تبدیلی، رونق اقتصادی ویژه ای را برای مناطق انارکاری به دنبال داشته است. عوامل مختلفی درخت انار و میوه آن را دچار خسارت های جبران ناپذیری می کنند. پوسیدگی های میوه انار یکی از مهم ترین مشکلات انارستان های سراسر کشور است. طی این بررسی قارچ های مهم عامل پوسیدگی ها و علائم آن شناسایی و بررسی شد. در بین عوامل دو گونه قارچی Alternaria alternata و Colletotrichum gloeosporioides بترتیب 25 و 54 درصد غالب پوسیدگی ها را موجب شدند که در سال های 93 تا 95 بیشترین آلودگی ها متعلق به C. gloeosporioides بود.
مقدمه
انار - نام علمی: - Punica granatum یکی از میوههای درختی است که دانههایی اغلب قرمز، و گاهی سفید، و یا به رنگهایی بین آن دو دارد. رنگ پوست آن نیز اغلب قرمز و گاه سیاه و یا تقریباً زرد است. از میوه انار، آب انار، رب انار، لواشک انار و مربای انار تهیه میشود. انار یکی از محصولات گروه میوه های نیمه گرمسیری است که از گیاهان بومی آسیای مرکزی و غربی است و می توان گفت که زادگاه اصلی آن فلات ایران می باشد و امروزه به دلیل خواص مختلف غذایی و دارویی آن مباحث پزشکی؛ مسائل کشاورزی آن را تحت الشعاع قرار داده است.
مشکلات انار شامل عوامل زنده و غیر زنده می شود که عوامل زنده شامل باکتری ها، قارچ ها، ویروس ها، حشرات و نماتدها می باشد. در این بین قارچ ها سهم عظیمی در نابودی انار بالاخص میوه انار دارند. بیماری های قارچی شامل پوسیدگی های ریشه، طوقه، تنه و سرشاخه های انار و لکه برگی ها و همچنین پوسیدگی های داخلی و بیرونی - سطحی - میوه انار می شود.
در بین این بیماری ها، بدلیل بازار پسندی و ماندگاری انار، لکه ها و پوسیدگی های قارچی روی میوه انار بسیار اهمیت داشته و در دنیا عواملی چون پنی سلیوم، آسپرژیلوس، سرکوسپورا، آلترناریا، کولتوتریکوم، بوترایتیس، Pilidiella، Nematospora، رایزوپوس، فوزاریوم و Belterraniella دخیل هستند.
باغات انار، امروزه از نطر درآمدزایی، اشتغال و تقاضای بالا برای صنایع تبدیلی، رونق اقتصادی ویژه ای را برای مناطق انارکاری به دنبال داشته است. تحقق این مهم از طریق شناخت دقیق عوامل خسارتزای انار و شناسایی راه های اصولی برای مدیریت کنترل و مبارزه با عوامل خسارتزای این محصول می باشد.
بیماری پوسیدگی قلب یا پوسیدگی سیاه میوه انار یکی از مهم ترین بیماری های انار به شمار می رود که در این بیماری، پوسیدگی سیاه رنگ از کالیکس میوه انتشار یافته و تمام بخش داخلی میوه را فاسد می کند در صورتی که پوست بیرونی و لایه ضخیم زیر آن همچنان سالم باقی می ماند. عامل این بیماری Alternaria alternata می باشد
جالب اینجاست ازرا و همکاران - 1 - مشخص ساختند که ایزوله های عامل لکه سیاه انار روی برگ ها ایجاد لکه می کنند اما عامل پوسیدگی سیاه - پوسیدگی داخلی یا قلب انار - روی برگ های انار ایجاد لکه برگی نمی کنند. در ترکیه هم عامل لکه میوه روی میوه و گل و برگ ها زخم ایجاد کرد
مواد و روش ها
از مناطق مختلف شرق استان مازندران 1070 عدد نمونه برداریصورت گرفت که 90 نمونه مربوط به گل و فندقه و 980 نمونه هم از میوه از باغ تا بازار بود. نمونه های گرفته شده همگی به آزمایشگاه قارچ شناسی گروه گیاهپزشکی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری منتقل شد. از لکه های مشکوک میوه، تیپ های هم گروه انتخاب و تکه های برداشت شده از سطح میوه شامل نواحی سالم و دارای لکه بعد از ضدعفونی با الکل 75 درصد و هیپوکلرید سدیم 1 درصد در آب شسته و با کاغذ صافی خشک شد و سپس در پتری های حاوی محیط PDA کشت داده شد. بعد از گذشت یک هفته در دمای اتاق از نمونه های رشد یافته کشت دوباره در محیط PDA صورت گرفت و بعد از گذشت یک هفته، خالص سازی با روش تک اسپور - 3 - صورت گرفت.
تک اسپورهای انتقال داده شده به پتری های حاوی محیط PDA بعد از گذشت 1 هفته در دمای اتاق به رشد مطلوب رسیدند و در نهایت مورد بررسی و شناسایی قرار گرفتند. بررسی با میکروسکوپ و عکسبرداری با دوربین و با میکروسکوپ صورت پذیرفت.
از کشت های 7 روزه نمونه های نماینده هر تیپ علائم از قبل مشاهده شده برای بیماریزایی استفاده شد. در این مرحله برای هر تیپ جداگانه از 6 ایزوله خالص شده استفاده گردید. همچنین در این آزمون از ارقام مختلف بهره برده شد. قطعات کوچک از هر پتری حاوی قارچ روی سطح پوست میوه های فاقد علائم - سالم - قرار داده شد. در این آزمون از ارقام متفاوت انار استفاده شد تا حساسیت ها هم در نطر گرفته شود. روی هر میوه محل هایی با زخم و بدون زخم مشخص شد.
بیماریزایی در سه تکرار صورت گرفت و نمونه کنترل - شاهد - هم در هر تکرار قرار داده شد که روی آن ها تیمار زخم و بدون زخم حاوی قطعه آگار و بدون آگار هم صورت گرفت. بعد از 5 - 7 روز علائم متفاوتی روی میوه ها مشاهده شد که اقدام به جداسازی، خالص سازی و شناسایی شد.
بخشی از کلنی های خالص شده از محیط PDA به لوله های کشت حاوی محیط PDA شیب دار شامل آنتی بیوتیک استرپتومایسین منتقل و در دمای 4 درجه ی سلسیوس یخچال نگهداری شد و هر 1 تا 3 ماه یکبار در صورت نیاز به لوله های جدید منتقل و تجدید کشت شدند.
بعد از اثبات بیماریزایی مقداری از هیف های قارچ از نمونه های نماینده تیپ های هر گروه از علائم از کشت های خالص شده با سوزن استریل به درون شیشه های حاوی محیط مایع PDB - ؛200 - - Potato Dextrose Broth گرم عصاره سیب زمینی و 15 گرم دکستروز در هزار میلی لیتر آب - منتقل و در دمای 25 درجه سلسیوس روی شیکر 120 - دور در دقیقه - قرار داده شد. بعد از 3 تا 5 روز توده های میسلیومی توسط آب مقطر استریل شسته شد و پس از آب گیری، در هاون حاوی ازت مایع پودر شد و پودرهای حاصل وارد ویال های استریل گردید. سپس 600 میکرولیتر بافر CTAB به ویال های حاوی پودر میسلیوم اضافه و ویال ها به بن ماری با دمای 65 درجه سلسیوس منتقل شدند.
در طول 30 دقیقه هر 10 دقیقه یکبار ویال ها بیرون آورده و چند بار برعکس شدند. سپس 600 میکرولیتر مخلوط کلروفرم -ایزوآمیل الکل - Chloroform-Isoamyl alcohol - ، - با نسبت - 24:1 به آن ها اضافه گردید. به مدت 10 دقیقه در 12000 دور سانتریفیوژ شدند و فاز رویی محتوی DNA به ویال جدید منتقل گردید.
هم حجم آن ایزوپروپانول خنک - - - 20 C به محتویات ویال اضافه و بعد از ده بار وارونه کردن ویال ها، به مدت 30 دقیقه در دمای -20 درجه سلسیوس نگهداری شدند. پس از این مدت تیوب ها، به مدت 15دقیقه در 13000 دور سانتریفیوژ شدند. در نهایت، پس از رسوب DNA ، فاز مایع تخلیه و رسوب حاصله با اتانول 70 درصد شستشو و بعد از خشک کردن رسوب DNA به هر ویال 70 میکرولیتر 1 Tris - TE میلی مولار و 10 EDTA میلی مولار - اضافه شد و به دمای منفی 20 درجه ی سلسیوس منتقل گردید.
پس از آماده سازی آگارز 1 درصد در بافر 5 - Tris Borate EDTA - TBE میکرو لیتر DNA همراه با 2 میکرولیتر محلول رنگی - xylene cyanol, bromophenol blue - به چاهک ها اضافه شد و با ولتاژ 76 ولت الکتروفورز گردید. رنگ آمیزی DNA استخراج شده بوسیله ی محلول اتیدیوم بروماید انجام شد و مشاهده توسط دستگاه Kodak Gel Logic 200 انجام گرفت.
تکثیر قطعات rDNA با مواد مورد نیاز تکثیر انجام شد. لازم به ذکر است که در این پژوهش ژن های مورد بررسی شامل نواحی - Internal transcribed spacer - ITS1- 4 بودند.
بعد از اطمینان از تکثیر نواحی مورد نظر مقدار 15 میکرولیتر از هر محصول در ویال های درب دار به طور جداگانه قرار داده شدند و نیز مقدار 10 میکرولیتر آغازگر - رفت یا برگشت - مورد نظر به ازای هر محصول برای توالی یابی به شرکت بیونیر کره جنوبی فرستاده شد.
توالی ژنوم بدست آمده، ازطریق نرم افزار بﻻست در پایگاه - http://www.ncbi.nlm.nih.gov - NCBI مورد بررسی قرار گرفت و همولوژی آن با سایر توالی های موجود در بانک جهانی ژن تعیین شد.
بعد از اطمینان از صحت توالی های بدست آمده بر اساس توالی های موجود در بانک های جهانی ژن، برای بررسی روابط فیلوژنتیکی از نرم افزارهای بیوانفورماتیکی موجود استفاده شد. ابتدا توالی های بدست آمده با نرم افزار BioEdit، رجبندی شدند. با استفاده از نرم افزار Mega 5 درخت های فیلوژنی با روش های Maximum Likelihood،Maximum Parsimony و-Neighbor Joining و با بوت استرپ 1000 ترسیم گردید. در انتها بعلت نبود تفاوت چشمگیر در 3 روش تنها درخت های ترسیم شده با روش Neighbor-Joining مورد استفاده قرار گرفت.
نتایج
از بین 1040 نمونه مورد بررسی 933 ایزوله قارچی جداسازی شد و مورد شناسایی مورفولوژیکی قرار گرفت که در مجموع 53.64 درصد مربوط به Colletotrichum sp. و 24.85 درصد Alternaria sp. بود. طبق آمار مشاهده شده 8.69 درصد جنس هایی غیر از دو گونه مورد بررسی همچون پنی سلیوم و آسپرژیلوس بود و بالاخره از 12.82درصد نمونه ها هم قارچی جدا نشد.
Alternaria sp.
قطر هیف ها 3.2 تا 4.8 میکرومتر، منشعب، دیواره دار، شفاف تا کمی شفاف، با دیواره ضخیم می باشند. کنیدی ها تک یا کمی مجتمع، گلابی شکل تا کمی دوکی با طول 50-8 میکرومتر و قطر 20-8 میکرومتر قهوه ای تا قهوه ای کم رنگ هستند.
Colletotrichum sp.
کنیدی های استوانه ای، شفاف با طول 8-30 میکرومتر و قطر 5-2 میکرومتر دارند.
پس از بررسی نمونه های تیمارشده با ایزوله های قارچی مشخص شد که مجموع 6.35 درصد بیمارگر ها مربوط به Colletotrichum sp. - شکل - 1 و 31.65 درصد Alternaria sp. بود
