بخشی از مقاله
چکیده: باکتریوسینها عبارتند از ترکیبات پروتئینی سنتز شده بوسیله ریبوزوم که توسط باکتریها به خارج از سلول منتشر شده و میتوانند در رشد سایر باکتریها ایجاد اختلال کنند. به دلیل لزوم کاربرد تجاری و مشخصات مطلوب و منحصر به فرد باکتریوسین باکتری های لاکتیکی، عمده تحقیقات باکتریوسینی در سه دهه بر روی این دسته از باکتری ها متمرکز شده است. پیش شرط یافتن یک ترکیب باکتریوسینی مناسب، غربالگری باکتریهای لاکتیکی است که قادر به تولید باکتریوسین میباشند و از آنجائیکه محصولات سنتی تخمیری، منبع عمده ای از باکتری های لاکتیکی متنوع هستند و پتانسیل خوبی برای کشف ترکیبات فعال بیولوژیکی جدید دارند.
لذا در این تحقیق چهل و دو سویه محلی باکتری لاکتوباسیلوس بولگاریکوس جداسازی شده از ماست سنتی منطقه اصفهان به روش لکه گذاری به عنوان روشی سریع با قابلیت تکرار پذیری بالا از لحاظ قابلیت تولید ترکیبات شبه باکتریوسینی علیه دو باکتری شاخص پاتوژن لیستریا مونوسیایتوژنز و اشریشیا کلی غربالگری شدند ونهایتاً باکتری لاکتوباسیلوس بولگاریکوس سویه بومی K41 جداسازی شده از ماست سنتی حومه شهرستان خمینی شهر به عنوان سویهای توانمند در تولید ترکیبات شبهباکتریوسینی، معرفی شد. در این تحقیق به منظور افزایش دقت روش لکهگذاری، از تکنیک عکسبرداری از پتری ها و پردازش تصویر استفاده شد.
مقدمه:
امروزه با تغییر در الگوی غذایی مردم، بیماری های جدیدی به وجود آمده و همچنین بیماریهای قدیمی به اشکال جدیدی مجدداً بروز یافته اندمصرف. کنندگان عموماً خواستار مواد غذایی عاری از میکروبهای بیماریزا، با حداقل اعمال فرآیند بر روی آنها و همچنین حداقل استفاده از نگهدارندههای شیمیایی، بدون تخریب کیفیت عطر و طعمی محصول می باشند .[6] یافته های اخیر در خصوص روش های نگهداری محصولات غذایی، عمدتاً به سوی نگهداری زیستی - Biopreservation - با تاکید بر باکتریهای اسید لاکتیک می باشد .[11]
نگهداری زیستی عبارتست از افزایش مدت زمان نگهداری و کنترل ایمنی محصولات غذایی با استفاده از موجودات زنده و به خصوص میکروارگانیسمها و یا محصولات مستخرج از آنها .[16] باکتریهای لاکتیکی قابلیت زیادی برای استفاده در نگهداری زیستی محصولات دارند زیرا مصرف آنها عمدتاً برای انسان ایمن و بی خطر است - GRAS - و همچنین میکروفلور رایج بسیاری از مواد غذایی می باشند .[11]
اثر ضدمیکروبی اصلی باکتریهای لاکتیکی به تولید اسید لاکتیک و کاهش pH مربوط میشود، به علاوه این میکروارگانیسمها ترکیبات ضدمیکروبی مختلفی نیز تولید میکنند که می توان آنها را به دو دسته ترکیبات با وزن ملکولی کم - LMM - نظیر پراکسید هیدروژن، دی اکسید کربن، دی استیل و ترکیبات با وزن ملکولی بالا - HMM - نظیر باکتریوسینها - Bacteriocins - تقسیمبندی نمود .[4]
در میان ترکیبات با وزن ملکولی بالا، باکتریوسینها توجه زیادی را در صنعت غذا به خود جلب کرده اند. باکتریوسینها، پپتیدها یا پروتئینهای خارج سلولی هستند که در ریبوزوم سنتز شده و دارای قدرت جلوگیری از رشد باکتریها و یا کشتن آنها میباشند .[7] از آنجائیکه ترکیبات پروتئینی سنتز شده توسط باکتریها با اثر بازدارندگی بر سایر باکتریها در گروه باکتریوسینها طبقه بندی می شوند، ترکیبات پروتئینی تولید شده توسط باکتریها تا زمانیکه از لحاظ توالی آمینواسیدی و نوکلئوتیدی توالییابی نشده اند، در دسته ترکیبات شبهباکتریوسینی یا - Bacteriocin-like inhibitory substances - BLIS قرار میگیرند .[7]
برای یافتن یک ترکیب باکتریوسینی مناسب، غربالگری باکتریهای لاکتیکی که قادر به تولید باکتریوسین میباشند لازم است. محصولات سنتی تخمیری، منبع عمده ای از باکتریهای لاکتیکی متنوع هستند و پتانسیل خوبی برای کشف ترکیبات فعال بیولوژیکی جدید دارند .[18] یکی از مهمترین محصولات سنتی تخمیری کشور ما، ماست است. دو باکتری استرپتوکوکوس ترموفیلوس و لاکتوباسیلوس دلبروکی - زیرگونه بولگاریکوس فلور عمده این محصول را تشکیل میدهند.
باکتری لاکتوباسیلوس دلبروکی - زیرگونه بولگاریکوس در دسته کشتهای آغازگر گِرمادوست با دمای بهینه رشد 42 درجه سانتیگراد قرار دارد و در تهیه ماست، پنیرهای سوئیسی و ایتالیایی کاربرد دارد. تاکنون گزارش های مختلفی مبنی بر تولید ترکیبات ضدمیکروبی توسط لاکتوباسیلوس بولگاریکوس علیه میکروب های پاتوژن و فسادزا ارائه شده است [8 , 3] که عمده آن ها به اثرات ناشی از پراکسید هیدروژن و اسیدهای آلی نسبت داده شده است، اما رِدی و همکاران - 1983 - گزارش کردند که باکتری لاکتوباسیلوس بولگاریکوس DDS14، یک ترکیب ضدمیکروبی متفاوت از پرکسیدهیدروژن و اسید لاکتیک تولید میکند و آنرا بولگاریکان - Bulgarican - نامیدند .[13]
در تحقیقی که در سال 2005 بر روی خواص باکتریوسینی باکتریهای لاکتیکی جدا شده از فرآوردهای لبنی سنتی ترکیه انجام شد، اَسلیم و همکاران اثر بازدارندگی سوپرناتانت استریل باکتریهای لاکتوباسیلوس بولگاریکوس، را علیه3 باکتری پاتوژن بررسی، و گزارش کردند که تمام سویهها بر روی میکروبهای پاتوژن اثر بازدارندگی دارند .[5] بر اساس اطلاعات ما، مطالعات اندکی در خصوص ردیابی ترکیبات شبه باکتریوسینی باکتری لاکتوباسیلوس بولگاریکوس انجام شده است لذا هدف از انجام این تحقیق ردیابی سویه ای باکتریایی از بین لاکتوباسیلوس بولگاریکوس های جداسازی شده از ماست های محلی ایران که بیشترین قابلیت را در تولید ترکیبات شبه باکتریوسینی داراست.
مواد و روش ها:
چهل و دو سویه باکتری لاکتوباسیلوس بولگاریکوس مورد استفاده در این تحقیق از کلکسیون میکروبی آزمایشگاه میکروبیولوژی - بیوتکنولوژی گروه علوم و صنایع غذایی دانشکده کشاورزی دانشگاه صنعتی اصفهان تامین شدند. این سویه ها در پروژه ای در سال 1387، در همین آزمایشگاه از ماستهای محلی ایران جداسازی و به سه روش مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و ملکولی شناسایی شده بودند .[1]
این باکتریها پس از مخلوط شدن با %30 گلیسرول، بطور منجمد در فریزر -80 درجه سانتیگراد نگهداری می شوند. باکتری های پاتوژن لیستریا مونوسایتوژنز واِشریشیا کلی O157:H7 به عنوان باکتری های شاخص گرم مثبت و گرم منفی به ترتیب از موسسه واکسن و سرم سازی رازی و کلکسیون میکروبی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز تهیه شدند. در این تحقیق از 3 محیط کشت MRS ساخت شرکت شارلو اسپانیا، BHI محصول شرکت مرک آلمان و به منظور ساخت محیط کشت - Tryptone soy agar yeast extract - TSAYE از محیط TSBساخت شرکت اُکسوئید انگلستان استفاده شد که بطور مجزا عصاره مخمر و آگار به آن اضافه گردید.
برای ردیابی ترکیبات شبه باکتریوسینی از روش لکه گذاری - Spot on lawn - استفاده شد که با اعمال تغییراتی در دستورالعمل ارائه شده توسط لیوز و مونتویل - 1991 - به انجام رسید .[10] باکتری لاکتیکی، در محیط MRS مایع کشت داده شده و پس از گرمخانه گذاری به مدت 24 ساعت در شرایط دمایی 37 درجه سانتیگراد و در حضور CO2 %10 ، ضریب جذب دانسیته نوری آن در طول موج 600 نانومتر، بین 0/8-1 تنظیم شد. محیط کشت TSAYE توسط 3 میکرولیتر از کشت باکتری لاکتیکی مذکور، لکهگذاری و در کنار شعله لکهها کاملا خشک شدند.
سپس پتریها به مدت 72 ساعت در دمای 30 درجه سانتیگراد و در آتمسفر حاوی CO2 %10، گرمخانه گذاری شدند تا باکتری رشد و متابولیتهای خود را تولید کند. باکتریهای شاخص یعنی لیستریا مونوسایتوژنز واِشریشیا کلی در محیط BHI مایع کشت داده شده و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 14 ساعت در شرایط هوازی، گرمخانه گذاری شدند سپس با افزودن محیط BHI مایع استریل، ضریب جذب دانسیته نوری آنها در طول موج 600 نانومتر روی 0/15 - ±0/02 - تنظیم و به میزان %1 حجمی/حجمی در محیط BHI مذاب حاوی 0/75 درصد آگار تلقیح شد.
BHI آگار مذاب تلقیح شده با باکتری شاخص، روی پتری حاوی TSAYE لکهگذاری شده با باکتری لاکتیکی، روکش شد و در اینکوباتور 37 درجه سانتیگراد در شرایط هوازی گرمخانه گذاری شده و پتریهای روکش شده با باکتریاِشریشیا کلی پس از 8 ساعت به یخچال 4 درجه سانتیگراد انتقال و پتریهای روکش شده با باکتری لیستریا مونوسایتوژنز پس از 24 ساعت از اینکوباتور خارج تا با هدف اندازهگیری قطر هاله و قطر لکه باکتریهای لاکتیکی، عکسبرداری شوند.
مدل و تنظیمات دوربین مورد استفاده جهت عکسبرداری در جدول 1 ذکر شده است. به منظور بهبود وضوح تصاویر و افزایش دقت اندازهگیری، فرآیند پردازش تصاویر توسط نرمافزار Adobe Photoshop CS5 انجام شد .[2] جزئیات پردازش تصاویر در جدول 2 آمده است. پس از یکسانسازی مقیاسها، قطر لکه لاکتیکی و هاله ایجاد شده در امتداد هم و در 3 جهت مختلف - 3 مشاهده - - شکل - 1 توسط نرم افزار مذکور، اندازهگیری و میانگین آنها ثبت شد. نتایج نهایی با عنوان میزان بازداری - Inhibition - ، به صورت نسبت قطر هاله ایجاد شده به قطر لکه لاکتیکی گزارش شدند - معادله . - 1
معادله :1
کلیه آزمون ها در سه تکرار و در قالب طرح کاملاً تصادفی، و مقایسه بین میانگین ها تحت آزمون تی-اِستیودنت - t-student - با حدود اطمینان - P 0/05 - % 95 انجام شد.
نتایج و بحث:
نتایج حاصل از غربالگری 42 سویه باکتری لاکتوباسیلوس بولگاریکوس جداسازی شده از ماستهای سنتی منطقه اصفهان از لحاظ توانایی آن ها در تولید ترکیبات شبه باکتریوسینی، علیهباکتری2 شاخص گِرم مثبت و گِرم منفی یعنی لیستریا مونوسایتوژنز واِشریشیا کلی به ترتیب در شکل 2 و 3 نشان داده شده است. اثر بازدارندگی باکتری های لاکتیکی به روش لکه گذاری بررسی، و نتایج نهایی با عنوان میزان بازداری - با حدود اطمینان - %95 ارائه شده انداز. آنجائیکه مرز هاله ممانعت از رشد باکتری شاخص در اطراف لکه لاکتیکی کاملاً واضح نبود و به منظور افزایش دقت اندازهگیری با استفاده از قابلیت بزرگنمایی تصاویر، از پتریها عکسبرداری و تصاویر حاصل، مورد پردازش قرار گرفتند.
