بخشی از مقاله
چکیده
سابقه تحقیق و هدف: با غربالگري میکروارگانیسمهاي بومی میتوان به آنزیمهاي پکتینولایتیکی دست یافت که خصوصیات منحصر به فردي در صنعت و کشاورزي داشته باشند. هدف این پروژه جداسازي نوعی از این دست آنزیمها است که در pHهاي اسیدي فعالتر هستند و بدین ترتیب میتوانند در استحصال بیشتر آب میوه به دام افتاده در پکتین میوهها موثرتر عمل نمایند. دادهها گویاي به دام افتادن 5-10 درصد آب میوه در پکتینها میباشد.
ضمن آنکه حذف آنزیمی پکتینها مشکلات ناشی از گرفتگی فیلترهاي کارخانجات آب میوهگیري در اثر انباشت بقایاي پکتینی را مرتفع میگرداند. آنزیمهاي پکتینولیتیکی یا پیوند هاي استري میان گالاکترونیک اسید و متانول را هیدرولیز - پکتین استرازها - و یا منجر به شکست پیوندهاي گلیکوزیدي پلیمرهاي پکتینی دیوارههاي سلولی گیاهان و برخی از میکروارگانیسمها میگردند - پلی گالاکترونازها، پکتین و پکتات لیازها - .
مواد و روش ها: در این تحقیق 12 سویه قارچ از نظر تولید پلیگالاکتروناز مورد بررسی قرار گرفتند. نمونهها جهت بررسی تولید آنزیم در محیط جداسازي %1 - پلی گالاکترونیک اسید، %5/1 آگار و100 میلیمولار استاتسدیم، - pH = 6 قرار گرفتند. سپس جهت بررسی قارچ با بالاترین میزان تولید آنزیم، مقداري از اسپورهاي هر گونه به مدت 2 روز در محیط تولید، شامل 5 - گرم در لیتر پلی گالاکترونیک اسید، 3 گرم در لیتر سولفات آمونیوم، 10 گرم در لیتر فسفات دي هیدروژن پتاسیم، 2 گرم در لیتر سولفات منیزیم، 0/7 میلیگرم در لیتر بورات سدیم، 0/5 میلیگرم در لیتر مولیبدات آمونیوم، 10 میلی گرم فرو سولفات آهن، 0/3 میلی گرم سولفات مس، 0/11 میلی گرم سولفات منگنز، 17/6 میلی گرم سولفات روي و 100 میلی گرم در لیتر استرپتومایسین - قرار گرفتند و سنجش فعالیت آنزیم با استفاده ازروش میلر صورت گرفت و بعد از آن جذب نوري در 530 نانومتر که معرف میزان فعالیت آنزیم در تبدیل سوبسترا است تعیین گردید.
یافته ها: در میان 12 گونه بیشترین تولید آنزیم مربوط به Phytophtora sp.,Botrytis cineraea، Sclerotinia scerotioruml، Rhizoctonia solani بودکه در سنجش فعالیت تولید آنزیم با معرف DNS ، به رنگ ارغوانی تیره درآمدند.
مقدمه
مواد پکتیکی مانند پکتین، پروپکتین و پکتیک اسیدها، داراي ساختار هتروپلیساکاریدي با وزن مولکولی بالا هستند که در ساختمان دیوارهي سلولی گیاهان به عنوان بخشی از دیواره و ماده اصلی تشکیل دهنده تیغه میانی سلولها یافت میشوند که باعث ثبات و استحکام ساختار بافتهاي گیاهی میشوند - 1 و . - 2 پکتینها با وزن ملکولی 25-360 کیلو دالتون چیزي در حدود 0/5 تا 4 درصد وزن یک گیاه تازه را تشکیل میدهند - . - 3
پکتیناز ها آنزیمهاي خارج سلولی هستند که توسط گیاهان و پاتوژنها تولید میشوند و در تخریب مواد پکتیکی دخالت میکنند. فرمهاي مختلفی از مواد پکتیکی در سلولهاي گیاهی وجود دارند و به همین دلیل پکتینازها نیز به شکلهاي مختلفی هستند - . - 4 در بسیاري از قارچ ها و باکتري هاي پاتوژنیک گیاهان میتوان پکتینازها را دید که قادرند به تخریب بافتهاي میزبان بپردازند.
آنزیمهاي پکتینولیتیک به سه گروه ديپلیمرازها، استرازها و پروتوپکتینازها تقسیم میشوند - 5 و . - 6 پلی گالاکترونازها1 - نوعی پروتوپکتیناز - با کاتالیز هیدرولیکی زنجیره پلی گالاکترونیک اسید پکتینها را کاتالیز میکنند. این آنزیم به طور وسیعی در فرآیندهاي غذایی و بر همکنش هاي قارچ-گیاه کاربرد دارند. پلی گالاکترونازها به دو صورت اندوپلیگالاکتروناز2 واگزوپلیگالاکتروناز3 وجود دارند.
انواع اگزو، مولکول پکتین را در انتهاي زنجیره ي پلیگالاکترونیک اسید میشکند و به طور نسبتا آرامی باعث کاهش زنجیره طویل آن میگردد. در حالی که نوع اندو به طور کاملا تصادفی بر روي تمامی پیوندها عمل و سبب کاهش اندازه و ویسکوزیته مولکول پکتین می شود - . - 7 پکتینازها نقش مهمی در ورود پاتوژن هاي گیاهی داخل و بین سلولی ایفا می کنند که منجر به مسدود شدن بافت آوندي و در نهایت پژمردگی گیاه می شوند - . - 8
فعالیت آنزیمی پکتینازها از پاتوژن هاي مختلف قارچی جهت بیماري پوسیدگی ساقه در ذرت مورد مطالعه قرار گرفته است. در این تحقیق گونههاي بیماري زاي مختلف فوزاریوم مورد مطالعه قرار گرفت و پکتینازها در این مطالعه دیده شد که در آغاز تخریب دیواره سلولی ایفاي نقش میکنند و بیشترین فعالیت را در طی 48 ساعت آغازین نشان دادند - . - 9 در تحقیق دیگري، آنزیم هاي پکتینولیتیک در بیماري آنتراکنوز در گیاه سویا موثر نشان داده شدند. هدف از این تحقیق بررسی برخی از عوامل بیماري زاي گیاهی قارچی و تعیین میزان تولید آنزیم پلی گالاکتروناز توسط آن ها می باشد.
مواد و روش ها:
پلی گالاکترونیک اسید و رتنیوم رد4 از شرکت سیگما خریداري شد. گونههاي قارچی اهدایی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوري بود. PDA به عنوان محیط نگهداري تمامی نمونه هاي قارچی استفاده شد. محیط جداسازي جهت بررسی فعالیت پلیگالاکترونازي سوش ها مورد استفاده قرار گرفت. تمامی محیطها پیش از استفاده در دماي121 0C به مدت 20 دقیقه اتو کلاو شدند.
نمونه هاي قارچی در محیط کشت به مدت سه روز در دماي 30 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. مقداري اسپور به میزان %5 حجم محیط تولید 5 - گرم در لیتر پلی گالاکترونیک اسید، 3 گرم در لیتر سولفات آمونیوم، 10 گرم در لیتر فسفات دي هیدروژن پتاسیم، 2 گرم در لیتر سولفات منیزیم، 0/7 میلیگرم در لیتر بورات سدیم، 0/5 میلیگرم در لیتر مولیبدات آمونیوم، 10 میلی گرم فرو سولفات آهن، 0/3 میلی گرم سولفات مس، 0/11 میلی گرم سولفات منگنز، 17/6 میلی گرم سولفات روي و 100 میلی گرم در لیتر استرپتومایسین - - pH=6 - به این محیط در شرایط استریل انتقال یافت و نمونه به مدت 2 روز در دماي 30 درجه سانتیگراد در 160 دور در دقیقه کشت داده شدند.
محیط تولید با کاغذ صافی واتمن فیلتر گردید و جهت سنجش فعالیت آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت پلی گالاکترونازي با اندازه گیري آزاد شدن واحدهاي گالاکترونیک اسید به عنوان گروه هاي احیایی توسط 500 میکرولیتر پلی گالاکترونیک اسید 1 در صد در بافر استات سدیم 20 میلی مولار به عنوان سوبسترا و 500 میکرولیتر از آنزیم تولیدي در pH=6 و دماي 30 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه با استفاده از روش میلر5 سنجیده شد. نمونهها پس از سرد شدن به مدت 10 دقیقه با دور r.p.m6000 سانتریفیوژ شدند و جذب در طول موج 530 نانومتر علیه نمونه شاهد تعیین شد.
نتایج و بحث
در مراحل نخست جداسازي، شناسایی سویه هاي قارچی از منابع طبیعی کشور که توانایی هیدرولیز پکتات را داشتند انجام شد. جداسازي و شناسایی قارچ ها ناحیه شفاف ایجاد شده اطراف کلنی قارچی به وجود آمد که بیانگر تولید آنزیم پلی گالاکتروناز است. از میان 12 سوش مختلف 8 سوش هاله بیشتري ایجاد کردند. میزان آنزیم تولید شده پس از دو روز در گونه هاي Phytophtora sp. , Botrytis cineraea ،Sclerotinia scerotioruml ،Rhizoctonia solani به حداکثر مقدار خود رسید - جدول. - 1 به طوري که در سنجش آنزیم با استفاده از DNS6 ، این نمونه ها رنگ ارغوانی تیره را تولید کردند - شکل. - 1 تولید آنزیم پلیگالاکتروناز در 48 ساعت به بیشترین مقدار خود رسید و پس از آن کاهش یافت.
