بخشی از مقاله
چکیده
کلونهاي بیماریزا و نشاندار ویروس در مطالعه برهمکنش ویروس-میزبان کارآیی زیادي دارند. در لوبیا، پنج ژن غالب و مغلوب آلودگی به ویروس موزائیک معمولی لوبیا - BCMV - را کنترل میکنند. به منظور مطالعه برهمکنش بین ویروس BCMV و ارقام افتراقی لوبیا، کلون بیماریزاي نژاد RU1 این ویروس ایجاد و با ژن کد کننده بتا گلوکورونیداز نشاندار شد. cDNA نشاندار شده ویروس سپس روي ارقام افتراقی لوبیا داراري ژنهاي bc-u، bc-1، bc-2، bc-3، وI با استفاده از آگروباکتریوم تلقیح شد.
نتیجه مطالعات هیستوشیمیایی با رنگ آمیزي GUS ، جزئیات جدیدي در مورد واکنش ارقام که قبلا از طریق روشهاي ایمیونولوژیکی و علائم شناسی مطالعه شده بودند نشان داد. این مطالعات همچنین از بروز نژادهاي شکننده مقاومت که علائم آنها به صورت تک نقطه قابل رویت بودند حکایت داشت . بمنظور مطالعه بیشتر این نژادها، کلون بیماریزا با ژن کد کننده GFP نشاندار شد که بدون تخریب بافت گیاهی قابل رویت بود. در این مقاله که اخیرا در مجله Virus Research چاپ شده است، جزئیات ایجاد کلون بیماریزا و استفاده از آن درمطالعه بر همکنش بین ویروس BCMV و لوبیا بحث می شود.
مقدمه
ویروس هاي موزائیک معمولی - Bean common mosaic virus, BCMV - و موزائیک نکروزیس لوبیا - Bean common mosaic necrosis virus, BCMNV - دو پاتوژن مخرب لوبیا در مناطق کشت این محصول محسوب می شوند. اگر چه روشهاي زراعی و استفاده از بذور سالم میزان شیوع این دو ویروس را کاهش می دهند ولی تنها روش موثر کنترل، استفاده از ارقام مقاوم است.
مقاومت به نژادهاي هر دو ویروس توسط چهار لوکوس bc-u، bc-1، bc-2 وbc-3 کنترل شده و ژنهاي موجود در این لوکوسها به صورت مغلوب به ارث می رسند . - 4 - علاوه بر ژنهاي bc ، ژن غالب I از طریق ایجاد واکنش فوق حساسیت باعث مقاومت در برابرBCMV و تعداد دیگري از اعضاء جنس پوتی ویروس می شود . - 3,4 - مطالعه برهمکنش بین ویروسهاي BCMV وBCMNV با ارقام افتراقی لوبیا بر اساس علائم شناسی و مطالعات سرولوژیکی استوار بوده و اگرچه کلونهاي بیماریزاي ویروس ابزار مهمی در اینگونه مطالعات محسوب می شوند - 17 - ، کلونهاي بیماریزا در مورد این دو ویروس گزارش نشده است.
ژنوم ویروسهاي BCMV و BCMNV مثل سایر اعضاء جنس پوتی ویروس RNA تک رشته اي مثبت به طول تقریبا 10.000 نوکلئوتید بوده و اصولا تکثیر و ایجاد کلونهاي بیماریزاي آنها ساده به نظر می رسد - 17 - ولی تکثیر چنین کلونهاي بیماریزایی با موانعی از قبیل سمیت ژنوم ویروس بر Escherichia coli همراه است. این مشکل از طرق مختلفی مثل قرار دادن یک یا چند اینترون در داخل cDNA برطرف می شود
قرار دادن اینترون در داخل cDNA ، تغییراتی را در توالی ژنوم آن ایجاد نمیکند و فقط بیان آن تحت کنترل پروموتور و ترمیناتور فعال تحت شرایط درون سلولی ضروري است. تلقیح cDNA بیماریزا با روش دستی یا استفاده از ابزارهایی مانند تفنگ ژنی امکانپذیر است ولی استفاده از آگروباکتریوم آسانترین و کاراترین روش گزارش شده است . - 1, 11 - نشاندار کردن کلون بیماریزاي ویروس با ژنهاي نشاندار اطلاعات بیشتري در مورد آلودگی در سطح سلولی در برگهاي تلقیح شده و تلقیح نشده را آشکار می سازد
ژنهاي نشاندار کد کننده GUS، GFP وLuciferase کاربردهاي متفاوتی داشته و در نقاط مختلفی در ژنوم پوتی ویروسها قابل استفاده هستند . - 8 - در این مقاله ایجاد کلون بیماریزاي نژاد RU1 ویروس BCMV ، تلقیح آن بوسیله آگروباکتریوم، نشاندار کردن آن با ژنهاي نشانگر و نیز کاربرد آن در مطالعه بر همکنش بین این ویروس و ارقام افتراقی لوبیا توضیح داده میشود.
مواد و روشها
ارقام افتراقی لوبیا از CIAT وUSDA و نژاد RU1 ویروس BCMV از USDA تهیه شدند. جهت کلونینگ cDNA بیماریزاي این نژاد از قطعات همپوشان تکثیر و کلون شده بر اساس سکانس گزارش شده این نژاد استفاده شد cDNA . - 13 - کامل این نژاد با استفاده از سایتهاي برشی XbaI وBamHI در داخل ناقل - 19 - PAGUS بین پروموتور 35S و ترمیناتورNOS قرار داده شد.
جهت قراردادن اینترون در داخل ناحیه ژنومی مربوط به P3-CI ازSOEing PCR استفاده شد . - 7 - براي تلقیح با آگروباکتریوم، کاست حاصل از cDNA ویروس و وکتور PAGUS با استفاده از سایتهاي برشی XhoI وSacI به داخل وکتور PCAMBIA 1300 منتقل شد. براي نشاندار کردن کلون بیماریزا با ژنهاي کد کننده GUS وGFP ، سکانس کدکننده این ژنها به ترتیب با استفاده از سایتهاي برشی مهندسی شده SalI وApaI وPmeI وSacII در داخل نواحی کد کننده P1-Pro وHc-Pro وRdRp وCP قرار داده شد.
نتایج و بحث
استراتژي تکثیر و کلونینگ cDNA بیماریزاي نژاد RU1 ویروس BCMV بر اساس توالی گزارش شده این نژاد - 13 - استوار بود. ابتدا شش قطعه RT-PCR که تمام ژنوم این نژاد را پوشش میداد، تکثیر و کلون شدند . - 16 - باستثناء یکی از کلونها که ناحیه بین نوکلئوتیدهاي 2815-5985 را پوشش میداد و در دو کلون مجزاي آن حذف نوکلئوتیدهاي AT در نواحی 3211-12 و 5275-76 ژنوم ویروس مشخص شد، بقیه کلونها سکانس مورد نظر را نشان دادند. حذف نوکلئوتیدهاي AT در دو کلون مجزاي این قطعه نشانگر سمیت آن براي E. coli بود. به منظور رفع این مشکل، اینترون IV مربوط به ژن ST-LS1 گوجه فرنگی به طول 189 نوکلئوتید بین نوکلئوتیدهاي 4211 و 4212 قرار داده شد
cDNA . - حاصل در ناقل PAGUS بین پروموتور 35S و ترمیناتور NOS قرار داده شده و بیماریزایی آن با تلقیح روي ارقام حساس لوبیا مشخص شد. به منظور تلقیح با آگروباکتریوم، کلون حاصل به داخل ناقل PCAMBIA 1300 - Cambia, Brisbone, Australia - منتقل و سپس در Agrobacterium tumefaciens GV 3101 تکثیر و نهایتا بیماریزایی آن با تلقیح روي ارقام حساس لوبیا به اثبات رسید. براي نشاندار کردن cDNA بیماریزاي ویروس BCMV جهت مطالعات درون سلولی، ژن کد کننده پروتئین GUS بین توالی کد کننده P1-Pro وHc-Pro قرار داده شد - شکل . - 1 کارایی این کلون با تلقیح آن روي ارقام حساس لوبیا و به دنبال آن مطالعه هیستوشیمیایی برگهاي تلقیح شده 6-7 روز پس از تلقیح به اثبات رسید.
شکل .1 شماتیک ساختار ژنومی ویروس BCMV و استراتژي طراحی و ایجاد کلون بیماریزاي ویروس. RB وLB دو انتهاي ناقل PCAMBIA 1300 هستند. e35S وNOST نشانگر پروموتور و ترمیناتور هستند. محل قراردادن اینترون با مثلث پررنگ و محل قرار دادن ژنهاي کد کننده GUS وGFP به عنوان نشانگر با مثلث باز مشخص شده اند.
مطالعه برهمکنش بین ویروسهاي BCMV وBCMNV با ارقام لوبیا به دلیل وجود نژادهاي زیاد این دو ویروس - 12 - و وجود ژنهاي مقاومت بیشتر - حداقل 5 ژن - - 4, 14, 18 - با پیچیدگیهاي فراوانی مواجه است. علیرغم اهمیت زیاد ویروسهاي BCMV وBCMNV ، اهمیت کنترل این ویروسهاي در مناطق تولید این محصول و شگفت انگیز بودن برهمکنش بین نژادهاي این دو ویروس با ژنوتیپهاي لوبیا، کلون بیماریزاي این دو ویروس تاکنون تهیه و در راستاي این نوع مطالعات مورد استفاده قرار نگرفته بود .
همچنانکه قبلا گزارش شده است - 6 - ، یکی از دلایل آن ممکن است مشکلات مربوط به کلون کردن این ویروسها در E. coli باشد، چنانچه حذف چند نوکلئوتید در ناحیه کد کننده P3-CI در طول این تحقیق مشاهده شده و با روش کاملا مهندسی شده قرار دادن یک اینترون در این ناحیه رفع شد. ایجاد کلونهاي بیماریزاي ویروسها این مزیت را دارد که میتوان آنها را با نشانگرهایی که همراه با تکثیر ویروس در سطح سلولی بیان میشوند، مجهز کرد. در این میان نتیجه بررسیهاي هیستوشیمیایی GUS بسیار حساس بوده و باسانی قابل رویت است.
حساسیت ژنوتیپهاي مختلف لوبیا به نژاد RU1 قبلا با استفاده از مطالعات علائم شناسی و سرولوژیکی ارزیابی شده است . - 10 - براي مطالعه بر همکنش ویروس BCMV و ارقام افتراقی لوبیا در سطح سلولی، کلون بیماریزا و نشاندار شده ویروس به طور مجزا روي ارقام داراي ژن مقاومت غالب I ، ژنهاي مقاومت مغلوب bc و ارقام حساس تلقیح شد.
تلقیح پنج رقم حساس DW ، CRM، SP ، SGR و The Prince با کلون بیماریزا و رنگ آمیزي برگهاي تلقیح شده 4 روز پس از تلقیح و برگهاي سیستمیک 1 هفته و 5 هفته پس از تلقیح نشانگر آلودگی سیستمیک تمام ارقام بود ولی پروفیل آلودگی ارقام DW وSGR با پروفیل آلودگی بقیه ارقام تفاوت بارزي نشان داد. این نکته بیانگر این واقعیت است که کلون بیماریزا جزئیات بیشتري در مورد حساسیت این ژنوتیپها و امکان وجود فاکتورهاي بیشتر در بعضی از این ژنوتیپها را ارائه میدهد که باعث محدود شدن قدرت آلوده کنندگی BCMV در بعضی از ژنوتیپهایی میشود که کاملا حساس گزارش شده اند.
مطالعات قبلی با روشهاي سرولوژیکی و علائم شناسی نشان داده است که ارقام داراي ژن غالب I در مقابل ویروس BCMV مقاومت کامل نشان میدهند . - 9, 10 - جهت بررسی این نوع مقاومت با جزئیات بیشتر در سطح سلولی، 6 رقم داراي ژن I به تنهایی - Widusa - یا در ترکیب با ژنهاي - Top Crop, ITG - bc-1، bc-12/bc- - IVT7233 - 22 یا - USCR7, Raven - bc-3جداگانه توسط کلون بیماریزا تلقیح شدند. مطالعات هیستوشیمیایی یک هفته پس از تلقیح ضمن تائید نتایج قبلی - 10 - از وجود آلودگی پراکنده در رقم ITG حکایت داشت که ممکن است در نتیجه واکنش فوق حساسیت وابسته به دما باشد . - 18 - لازم به ذکر است که رقم اخیر در مطالعات علائم شناسی کاملا مقاوم به RU1 گزارش شده بود
ارقام فاقد ژن غالب - I ارقام دارا ژنوتیپ - ii ولی داراي ژن bc-u در ترکیب با ژنهاي bc-1 ، bc-12 یا bc-2 جزء ارقام حساس و ارقام داراي ژن bc-u در ترکیب با ژنهاي bc-1/bc-2، bc-12/bc-22 یا bc-2/bc-3 جزء ارقام مقاوم به BCMV طبقه بندي شده اند - . - 4, 10 بمنظور بررسی کارایی کلون بیماریزاي RU1 در نشان دادن نتایج مشابه و ارائه اطلاعات بیشتر در زمینه مقاومت برگرفته از ژنهاي bc، یازده ژنوتیب داراي ترکیبات مختلف از ژنهاي bc با کلون بیماریزا تلقیح شد.
مطالعات هیستوشیمیایی یک هفته و پنج هفته پس از تلقیح از آلودگی ژنوتیپهاي داراي ژن bc-u در ترکیب با ژنهاي bc-1، bc-12 یا bc-2 حکایت داشت. تنها استثناء موجود در این زمینه ژنوتیپ Pinto-114 با ترکیب ژنی bc-u/bc-1/bc-2 بود که برخلاف نتایج گزارش شده قبلی - 10 - به کلون بیماریزا حساسیت نشان داد، در صورتیکه ژنوتیپ دیگر با این ترکیب ژنی - UI-114-8 - در مطالعات قبلی با استفاده از علائم شناسی و آزمونهاي سرولوژیکی مقاوم به BCMV گزارش شده بود . - 10 - به هر حال رنگ آبی در ژنوتیپ Pinto-114 بسیار ضعیف بوده و کاملا با ارقام حساس متفاوت بود و شاید به این دلیل است که در مطالعات علائم شناسی، علائم بیماري در این ترکیب ژنی قابل رویت نبوده است.
