بخشی از مقاله
چکیده:
غالبا ریزازدیادي میخک - Dianthus caryophyllus L. - در محیط کشت هاي جامد صورت می گیرد و یکی از محیط کشت هاي مرسوم تجاري که می تواند کاربردهاي زیادي در تولید تجاري میخک داشته باشد، محیط کشت MS می باشد . با این وجود بیشترین گزارش در ارتباط با پدیده شیشه اي شدن، در این محیط کشت گزارش شده است . زیرا این محیط کشت حاوي درصد بالایی از نیترات آمونیوم می باشد. از سوي دیگر با تغییر در نسبت آمونیوم به نیترات و غلظت آگار در محیط کشت می توان میزان این پدیده را کاهش داد.
لذا جهت بررسی تاثیر این دو عامل بر میزان تکثیر و پدیده شیشه اي شدن میخک - Dianthus caryophyllus L. - رقم Skimo Mogr، آزمایشی بصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با دو فاکتور غلظت آگار 0 - ، 8 ، 10 و 12 گرم در لیتر - و نسبت آمونیوم به نیترات 1:2 - ، 1:4 و - 1:6 با 10 تکرار انجام شد. در این بررسی، ریزنمونه هاي جوانه جانبی در محیط کشت MS حاوي 1 میلی گرم در لیتر BA و 0/1 میلی گرم در لیتر NAA همراه با تیمارهاي مختلف - غلظت هاي متفاوت آگار و نسبت هاي مختلف نیترات به آمونیوم - کشت گردیدند .
نتایج نشان داد که نسبت آمونیوم به نیترات تاثیر معنی داري بر میزان پرآوري و درصد شیشه اي شدن ریزنمونه ها داشت. با کاهش نسبت آمونیوم به نیترات میزان پدیده شیشه اي کاهش و تعداد شاخساره باززایی شده افزایش یافت. همچنین اثر غلظت آگار نیز بر میزان باززایی و پدیده شیشه اي شدن معنی دار بود بطوریکه با افزایش غلظت آن از 0 به 10 گرم در لیتر، تعداد شاخساره باززایی شده افزایش یافت و پس از آن روند کاهشی از خود نشان داد. زیرا افزایش غلظت آگار باعث محدودیت در جذب مواد غذایی توسط گیاه می شود. در ارتباط با میزان شیشه اي شدن نیز افزایش غلظت آگار از 0 به 12 گرم در لیتر باعث کاهش میزان پدیده شیشه اي شدن شد. بنابراین با درنظر گرفتن میزان شاخه زایی و پدیده شیشه اي شدن، براي بدست آوردن بیشترین شاخه طبیعی، غلظت 10 گرم در لیتر آگار همراه با نسبت 1:6 آمونیوم به نیترات توصیه می شود.
مقدمه:
یکی از مشکلات متداول در طی فرایند کشت بافت میخک، پدیده شیشه اي شدن می باشد . - 4 - برخی پژوهشگران با تغییر در نسبت آمونیوم به نیترات و غلظت آگار محیط کشت، افزایش در پرآوري و کاهش پدیده شیشه اي شدن را گزارش کرده اند
افزایش غلظت آگار باعث کاهش پتانسیل اسمزي محیط کشت می شود، در نتیجه پدیده شیشه اي شدن نیز کاهش می یابد. اما در عین حال تاثیر نامطلوبی بر جذب عناصر غذایی و هورمون هاي موجود در محیط کشت داشته و باعث کاهش رشد گیاهچه ها می شود. نسبت آمونیوم به نیترات نیز به عنوان یک عامل کلیدي در رشد گیاهان مختلف مطرح است. کاهش نسبت آمونیوم به نیترات در محیط کشت نه تنها توانایی تشکیل جوانه را افزایش می دهد، بلکه میزان پدیده شیشه اي شدن را نیز کاهش می دهد . - 4 - لذا هدف از پژوهش حاضر بررسی تاثیر غلظت آگار و نسبت آمونیوم به نیترات بر کشت درون شیشه اي میخک و میزان پدیده شیشه اي شدن بود.
مواد و روش ها:
در این پژوهش گیاهان میخک رقم Skimo Mogr در شرایط محیطی مناسب در گلخانه نگهداري و از آنها براي تهیه ریزنمونه استفاده شد. گیاهان شاداب، عاري از بیماري و در مرحله رشد فعال انتخاب و ریزنمونه هاي جوانه هاي جانبی به اندازه 1 سانتی متر از آنها تهیه و براي کشت آماده شدند. ریزنمونه ها ابتدا به مدت 30 دقیقه در زیر آب جاري شستشو و سپس به مدت 15 دقیقه با محلول دو درصد هیپوکلریت سدیم ضدعفونی گردیدند. ریزنمونه هاي ضدعفونی شده تحت شرایط استریل 3 مرتبه با آب مقطر استریل شستشو شده و جوانه هایی به طول 3 تا 5 میلی متر از آنها تهیه و کشت گردیدند.
در این بررسی از محیط کشت جامد - MS موراشیگ و اسکوگ - حاوي 1 میلی گرم در لیتر BA در ترکیب با 0/1 میلی گرم در لیتر NAA ، 3 درصد ساکارز ، pH=5/7 و تیمارهاي مختلف شامل غلظت هاي متفاوت آگار 0 - ، 8 ، 10 و 12 گرم در لیتر - و نسبت هاي مختلف آمونیوم به نیترات 1:2 - ، 1:4 و - 1:6 استفاده گردید. محیط کشت ها در لوله هاي آزمایش به میزان 13 میلی لیتر توزیع گردیده و به مدت 15 دقیقه در دماي 121 درجه سانتی گراد اتوکلاو گردیدند. پس از کشت ریزنمونه ها در لوله هاي آزمایش، ریزنمونه ها به شرایط نوري 16 ساعت روشنایی - 2500-3000 لوکس - در دماي 25±1 درجه سانتی گراد منتقل شده و در فاصله زمانی هر 4 هفته واکشت انجام شد. در پایان هر واکشت عکس العمل ریزنمونه ها مورد ارزیابی قرار گرفت.
براي ریشه زایی شاخه هاي تکثیر شده از محیط کشت MS حاوي 1 میلی گرم در لیتر NAA استفاده شد و در نهایت گیاهان ریشه دار شده به گلدان هاي حاوي مخلوطی از ماسه، پیت و خاك باغچه با نسبت حجمی 1:1:1 منتقل شدند و مراحل سازگاري در شرایط محیطی 23±2 درجه سانتی گراد و 16 ساعت روشنایی صورت گرفت و سپس گیاهان سازگار شده به شرایط گلخانه انتقال یافتند. این بررسی به صورت آزمایش فاکتوریل با 2 فاکتور غلظت آگار 4 - سطح - و نسبت آمونیوم به نیترات 3 - سطح - در قالب طرح کاملا تصادفی با 10 تکرار و آزمون مقایسه میانگین ها با استفاده از آزمون چند دامنه اي دانکن انجام شد. نرمال سازي داده هاي درصدي آزمایش - درصد شیشه اي شدن - با استفاده از فرمول [ArcSin Sqrt - X/100 - ] صورت گرفت.
نتایج و بحث:
نتایج نشان داد که با افزایش غلظت آگار تا سطح 10 گرم در لیتر، تعداد جوانه باززایی شده به میزان %40 افزایش یافت و پس از آن روند کاهشی از خود نشان داد. بیشترین و کمترین تعداد جوانه باززایی شده به ترتیب در غلظت 10 و 12 گرم در لیتر آگار با میانگین 1/87 و 1/13 مشاهده شد. همچنین نتایج پژوهش حاضر نشان داد که با افزایش غلظت آگار تا 12 گرم در لیتر، پدیده شیشه اي شدن %70 کاهش یافت. بیشترین میزان پدیده شیشه اي شدن در محیط کشت مایع - %51/67 - و کمترین میزان آن در محیط کشت حاوي 12 گرم در لیتر آگار - %15 - مشاهده شد.
مقایسه میانگین داده هاي آزمایش نشان داد که بیشترین تعداد جوانه رشد یافته - 2/15 - در نسبت 1:6 آمونیوم به نیترات و کمترین میزان آن - 1/2 - در نسبت 1:2 آمونیوم به نیترات بدست آمد. بین تیمارهاي 1:2 و 1:4 از نظر میزان باززایی اختلاف معنی داري مشاهده نشد. بین نسبت هاي مختلف آمونیوم به نیترات اختلاف معنی داري از نظر میزان پدیده شیشه اي شدن مشاهده نشد، با این حال با کاهش نسبت آمونیوم به نیترات روند کاهشی در میزان پدیده شیشه اي شدن مشاهده شد، بطوریکه با کاهش این نسبت از 1:2 به 1:6، درصد گیاهچه هاي شیشه اي شده از %35 به %22/5 کاهش یافت.
بررسی تحقیقات سایر محققان نشان می دهد که افزایش غلظت آگار باعث کاهش پتانسیل اسمزي محیط کشت می شود و در نتیجه پدیده شیشه اي شدن نیز کاهش می یابد . اما در عین حال تاثیر نامطلوبی بر جذب عناصر غذایی و هورمون ها در محیط کشت داشته و باعث کاهش رشد گیاهچه ها نیز می گردد
نتایج پژوهش هاکارت و ورسلویجز - 1983 - نشان داد که افزایش غلظت آگار از 6 به 12 گرم در لیتر باعث کاهش پدیده شیشه اي شدن در گیاه میخک شد ولی در عین حال ارتفاع گیاهچه هاي باززایی شده را نیز کاهش داد. بنابراین براي حصول گیاهچه هاي سالم و همچنین تعدیل اثرات نامطلوب غلظت بالاي آگار بر صفات رویشی گیاهچه، غلظت 8 تا 10 گرم در لیتر آگار را توصیه کردند.
لاپنا و همکاران - 1992 - گزارش کردند که بیشترین درصد باززایی در محیط کشت حاوي 7 گرم در لیتر آگار بدست آمد و با افزایش غلظت آگار تا 12 گرم در لیتر میزان باززایی گیاهچه ها و همچنین پدیده شیشه اي شدن نیز کاهش یافت. زیو و آریل - 1992 - تاثیر نسبت هاي مختلف آمونیوم به نیترات را در محیط کشت جامد و مایع بر ریزنمونه هاي نوك شاخساره میخک بررسی کردند.
نتایج پژوهش آنها نشان داد که تاثیر کاهش نسبت آمونیوم به نیترات بر میزان پدیده شیشه اي شدن در محیط کشت مایع در مقایسه با محیط کشت جامد بیشتر است.لاپنا و همکاران - 1992 - گزارش کردند که با کاهش نسبت آمونیوم به نیترات در محیط کشت، نه تنها درصد باززایی افزایش می یابد، بلکه میزان پدیده شیشه اي شدن نیز کاهش می یابد بر اساس نتایج این پژوهش و همچنین گزارش هاي سایر محققان می توان بیان نمود که با درنظر گرفتن میزان شاخه زایی و میزان شیشه اي شدن آنها، براي بدست آوردن بیشترین شاخه طبیعی، غلظت 10 گرم در لیتر آگار همراه با نسبت 6:1 آمونیوم به نیترات براي رقم Skimo Mogr میخک توصیه می شود.
